Aislamiento y purficación de lisozima de clara de huevo de gallina

Aislamiento y purificación de lisozima de clara de huevo de Gallus gallus domesticus
Antonio González Vázquez
Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular, 2º Grado en Bioquímica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Complutense de Madrid.

INTRODUCCIÓN
La clara de huevo de Gallus gallus domesticus constituye una gran fuente de proteínas muy útiles para su estudio, además de otroscomponentes como pueden ser minerales, materiales grasos, vitaminas y glucosa. Entre las proteínas se encuentran la ovoalbúmina, que es la proteína más abundante, la ovomucina, la ovomucoide, la conalbúmina y la lisozima [1].
La lisozima (EC 3.2.1.17; muramidasa) cataliza la hidrólisis de los peptidoglicanos que forman la pared bacteriana. En concreto, cataliza la hidrólisis entre los polímeros deN-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico unidos por enlaces β (1-4). Su sensibilidad dependerá, por tanto, del porcentaje de peptidoglicanos presentes en la pared bacteriana, variable en función del tipo de bacteria: Gram-positivas (40-90%) o Gram-negativas (10%) [2].
La lisozima de clara de huevo de Gallus gallus domesticus está constituida por una única cadena polipeptídica, formada por 129aminoácidos, conteniendo cuatro puentes disulfuro. Su peso molecular es de 14.4 kDa y tiene un punto isoeléctrico de 10.7, por lo que se trata de una proteína básica.
La lisozima fue la primera proteína de la que se dispuso de un modelo en 3D por cristalografía de rayos X. Debido a su alto punto isoeléctrico, la lisozima fue de las primeras proteínas que se pudo purificar y consecutivamentesecuenciar [3]. Su efecto bacteriolítico fue descubierto por Fleming en el año 1922, dejando constancia de su gran actividad frente a las paredes del género Micrococcus [3].
La purificación de la lisozima de clara de huevo ya ha sido descrita con anterioridad [1-3].
Objetivos
Diseñar un experimento que nos permita aislar y purificar la lisozima de clara de huevo de gallina en función de suspropiedades, tales como el punto isoeléctrico o su actividad catalítica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Huevo de Gallus domesticus, paredes de Micrococcus lysodeikticus (Sigma), albúmina de suero bovino (BSA, Sigma), patrones de masa molecular (BIO-RAD), Sephadex G-75 (Pharmacia), Amberlita CG-50 (Sigma), reactivo de Bradford (BIO-RAD), acrilamida/bisacrilamida/SDS/glicocola (SERVA), persulfatoamónico/Tris (SERVA), TEMED (BIO-RAD), azul de Bromofenol (Fluka), azul de Coomassie (Sigma), ácido acético y metanol (Scharlab S.L.).
Preparación del extracto enzimático
La clara, separada del huevo, se diluye con 3 volúmenes de acético 0.1 M y se filtra tras agitar.
Tratamiento ácido y tratamiento térmico
Se centrifuga el extracto enzimático (4500 rpm, 5 min). Del sobrenadante (E1), se guardauna alícuota (1 mL) en nevera. Se incuba el sobrenadante E1 en un baño de agua (60ºC, 5 min). Se enfría en hielo (5 min) y se centrifuga (4500 rpm, 5 min). Del sobrenadante (E2), se guarda una alícuota (1 mL) en nevera.
Purificación por cromatografía de intercambio iónico
Se disuelven, por cada 10 mL de E2, 2 mL de tampón fosfato potásico 1M, pH 7.0. El tipo de resina es Amberlita CG-50, cuyafase estacionaria está formada por aniones de carboximetil celulosa. Se carga la muestra en la columna, equilibrada con tampón fosfato potásico 0.1 M, pH 6.6. La matriz se lava sucesivamente con tampón fosfato potásico 0.1 M, pH 6.6 y tampón fosfato potásico 0.6 M, pH 6.6.
Determinación de la actividad enzimática
La actividad enzimática se mide a través de la velocidad de lisis de las paredes deM.lysodeikticus [4]. Una unidad de actividad enzimática para la lisozima (UAL) es igual a la disminución en la absorbancia de 0.001/min a 450 nm en condiciones estándar (25ºC, pH 6.6, fosfato 0.1 M). Para el ensayo enzimático se escogen los tubos de mayor concentración de lisozima según el perfil cromatográfico.
Determinación de concentración de proteínas
La concentración de proteínas se...