Alamar azul

Alamar Azul

Materiales:
Tubos de vidrio 13x100mm, estériles, con tapón de rosca.
Cajas de Petri, estériles, 100x15mm.
Cajas de Petri, estériles, 55x100mm.
Rack + Puntas para pipeta automática200 a 1000µL (azules), estériles.
Rack + Puntas para pipeta automática 20 a 200µL (amarillas).
Pipetas de vidrio, con algodón 5mL.
Pipetas de vidrio, con algodón 10mL.
Placa con 96 pozos.
Frascocon cloro (150mL).
Pipetas (200µL, 1000µL).
Pipeta múltiple.
Tubos eppendorf 1.5mL.

Soluciones:
• 10mL de agua estéril.
• 30mL de 7H9 (DIFCO) con glicerol (10% de OADC) para Mtb. (7H9p)
•1.5mL de solución de alamar azul.
• 1mL de solución stock de fármacos (concentración 1mg/mL) o compuestos (a concentración 10mg/mL).

Metodología Sensibilidad a fármacos
Preparación de la suspensiónbacteriana
1. A partir de medio líquido, tomar una alícuota de 1mL de crecimiento bacteriano en fase logarítmica (de 2 a 5 semanas) crecido en medio de cultivo 7H9 con glicerol (y 10% de enriquecidocon OADC), y transferido a un tubo de ensayo de 13x100mm.

2. Ajustar la suspensión al tubo No. 1 del nefelómetro de Mc Farland con medio de cultivo 7H9p (suspensión 1).

3. Hacer una dilución1:50 de la suspensión 1 con medios de cultivo 7H9p. Preparar un volumen final de 7.5mL si se va a preparar en placa. Esta constituirá la suspensión de trabajo. La dilución se hace directamente en la cajade Petri.

Preparación de los fármacos
1. En tubos eppendorf estériles, de 1.5mL, realizar diluciones de cada fármaco o compuesto a probar a partir del stock para tener en volumen final de 300µL.Marcar cada tubo con el nombre del fármaco (la dilución será adecuada para tener en el tubo una concentración cuatro veces mayor (4x) a la que se desea probar). Cerrar el tubo y mezclar perfectamentepor agitación. Esta será la solución de trabajo.

Preparación de la microplaca
1.- Tomar una microplaca para cultivo de 96 pozos nueva, retirarla de su empaque y orientarla de acuerdo al esquema:...