Alfa Amilasa
Páginas: 5 (1097 palabras)
Publicado: 27 de junio de 2012
LABORATORIO DE FISIOLOGÍA CELULAR VEGETAL
UNIVERSIDAD ANDRÉS BELLO
PRÁCTICO 6
Actividad (-amilasa en semillas de cebada durante la germinación
Introducción
La degradación del almidón ha sido estudiado principalmente durante el proceso de germinación de la semilla. Está bien establecido que la (-amilasa es una de las enzimas más importantes relacionadas con la degradación delalmidón presente en el endosperma de las semillas de gramíneas y en las semillas de leguminosas. Sin embargo, para la degradación completa del almidón a glucosa se requiere de la acción concertada de otras enzimas glicolíticas, tales como (-amilasa, gama-amilasa, dextrinasa límite, (-glucosidasa y (-1,4 glucano fosforilasa (Juliano y Varner, 1969; Preiss and Levi, 1982; Steup,1988). Las amilasasson enzimas que hidrolizan enlaces ( (1(4) de polisacáridos correspondientes a homopolímeros de residuos de glucosa enlazados por enlaces ( (l(-4) y ( (l(6): glicógeno y almidón. Basándose en la posición del enlace que éstas hidrolizan y en la estereoquímica del producto generado durante la reacción, se distinguen varios tipos de amilasas: endoamilasas ((-amilasas E.C. 3.2.1.1) que hídrolizanenlaces ( (l(4) internos tanto de la amilosa como de la amilopectina, produciendo oligosacáridos con un grupo reductor libre con configuración óptica alfa; exoamilasas ((-amilasas E. C. 3.2.1.2) que se caracterizan por hidrolizar el almidón desde el extremo terminal no reductor de la molécula, dando como producto, maltosa que tiene configuración óptica beta.
La enzima (-amilasa esresistente a 70C°, mientras que la (-amilasa se desnaturaliza a esta temperatura, otra característica de esta proteína, es su labilidad a pH inferior a 4,0. Las isoformas de la (-amilasa encontradas en semillas de cereales son metaloenzimas que contienen Ca+2. La actividad y estabilidad de la proteína depende de la presencia de este cofactor. Estudios realizados por Bush y col. (1989) indican que elcalcio es requerido para estabilizar la estructura de la (-amilasa de cebada en el retículo endoplásmico (RE) de la capa de aleurona donde las enzimas son sintetizadas.
La hidrólisis del almidón en el endosperna genera glucosa y maltosa, los que finalmente son movilizados hacia el embrión en crecimiento en forma de sacarosa para mantener el crecimiento temprano de la plántula.Existen varias isoenzimas de (-amilasa en las semillas de cereales como también en el embrión. En cereales las isoenzimas se pueden separar en dos grupos por isoelectoenfoque, las que emigran a bajo punto isoeléctrico (bajo pI) y las que emigran a alto punto isoeléctrico (alto pI). Las isoformas de (-amilasa tienen una masa molecular que va desde los 44 kDa hasta 50 kDa.
Objetivos
Medir laactividad de (-amilasa en semillas de cebada
Materiales
Solución A: 100 mM acetato de Na, pH 5,6
3 mM CaCl2
0.15 % almidón soluble
Solución B: KI : I2 = 6 :0,6 % (w/v).
Procedimiento
Extracción de amilasa para su análisis mediante electroforesis.
La extracción de la enzima a partir de las semillasse realiza de acuerdo al método de Nyman (1971). Las semillas se homogeneizan en amortiguador de a 4°C. Este contiene acetato de sodio 0,04, M a pH 4 8, CaCl2 0,02 M, NaCl 0,06 M. El homogeneizado se centrifuga a 10.000 rpm (8.000 g) en una centrífuga refrigerada por 15 minutos. El sobrenadante se extrae con una pipeta Pasteur, eliminándose la capa superior de lípidos. Este sobrenadante quecontiene la mayor parte de las proteínas se calienta a baño María a 70°C por 15 minutos. Después de calentado, se enfría en un baño de hielo que hace precipitar las proteínas y se centrifugado a 8.000 rpm (5.000g) por 5 minutos. El sedimento que contiene las proteínas precipitadas se descarta.
Actividad enzimática de alfa-amilasa
La preparación de enzima (1 ml) es incubada con 0,15% de...
UNIVERSIDAD ANDRÉS BELLO
PRÁCTICO 6
Actividad (-amilasa en semillas de cebada durante la germinación
Introducción
La degradación del almidón ha sido estudiado principalmente durante el proceso de germinación de la semilla. Está bien establecido que la (-amilasa es una de las enzimas más importantes relacionadas con la degradación delalmidón presente en el endosperma de las semillas de gramíneas y en las semillas de leguminosas. Sin embargo, para la degradación completa del almidón a glucosa se requiere de la acción concertada de otras enzimas glicolíticas, tales como (-amilasa, gama-amilasa, dextrinasa límite, (-glucosidasa y (-1,4 glucano fosforilasa (Juliano y Varner, 1969; Preiss and Levi, 1982; Steup,1988). Las amilasasson enzimas que hidrolizan enlaces ( (1(4) de polisacáridos correspondientes a homopolímeros de residuos de glucosa enlazados por enlaces ( (l(-4) y ( (l(6): glicógeno y almidón. Basándose en la posición del enlace que éstas hidrolizan y en la estereoquímica del producto generado durante la reacción, se distinguen varios tipos de amilasas: endoamilasas ((-amilasas E.C. 3.2.1.1) que hídrolizanenlaces ( (l(4) internos tanto de la amilosa como de la amilopectina, produciendo oligosacáridos con un grupo reductor libre con configuración óptica alfa; exoamilasas ((-amilasas E. C. 3.2.1.2) que se caracterizan por hidrolizar el almidón desde el extremo terminal no reductor de la molécula, dando como producto, maltosa que tiene configuración óptica beta.
La enzima (-amilasa esresistente a 70C°, mientras que la (-amilasa se desnaturaliza a esta temperatura, otra característica de esta proteína, es su labilidad a pH inferior a 4,0. Las isoformas de la (-amilasa encontradas en semillas de cereales son metaloenzimas que contienen Ca+2. La actividad y estabilidad de la proteína depende de la presencia de este cofactor. Estudios realizados por Bush y col. (1989) indican que elcalcio es requerido para estabilizar la estructura de la (-amilasa de cebada en el retículo endoplásmico (RE) de la capa de aleurona donde las enzimas son sintetizadas.
La hidrólisis del almidón en el endosperna genera glucosa y maltosa, los que finalmente son movilizados hacia el embrión en crecimiento en forma de sacarosa para mantener el crecimiento temprano de la plántula.Existen varias isoenzimas de (-amilasa en las semillas de cereales como también en el embrión. En cereales las isoenzimas se pueden separar en dos grupos por isoelectoenfoque, las que emigran a bajo punto isoeléctrico (bajo pI) y las que emigran a alto punto isoeléctrico (alto pI). Las isoformas de (-amilasa tienen una masa molecular que va desde los 44 kDa hasta 50 kDa.
Objetivos
Medir laactividad de (-amilasa en semillas de cebada
Materiales
Solución A: 100 mM acetato de Na, pH 5,6
3 mM CaCl2
0.15 % almidón soluble
Solución B: KI : I2 = 6 :0,6 % (w/v).
Procedimiento
Extracción de amilasa para su análisis mediante electroforesis.
La extracción de la enzima a partir de las semillasse realiza de acuerdo al método de Nyman (1971). Las semillas se homogeneizan en amortiguador de a 4°C. Este contiene acetato de sodio 0,04, M a pH 4 8, CaCl2 0,02 M, NaCl 0,06 M. El homogeneizado se centrifuga a 10.000 rpm (8.000 g) en una centrífuga refrigerada por 15 minutos. El sobrenadante se extrae con una pipeta Pasteur, eliminándose la capa superior de lípidos. Este sobrenadante quecontiene la mayor parte de las proteínas se calienta a baño María a 70°C por 15 minutos. Después de calentado, se enfría en un baño de hielo que hace precipitar las proteínas y se centrifugado a 8.000 rpm (5.000g) por 5 minutos. El sedimento que contiene las proteínas precipitadas se descarta.
Actividad enzimática de alfa-amilasa
La preparación de enzima (1 ml) es incubada con 0,15% de...
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