aminoacidos

El método consiste en una saponificación directa a la muestra seguido de una extracción del colesterol contenido en la fracción insaponificable. El extracto es analizado por GC-FID para determinar elcontenido de colesterol, utilizando un estándar interno.

Saponificación directa de la muestra.
• Pesar de 0,1 mg - 0.3 g de muestra en un tubo de centrifuga de 50 mL con tapa rosca.
• Adicionar500 μL de la solución de ISTD 2 mg/mL.
• Adicionar 3 mL de la solución de KOH al 50%.
• Adicionar 15 mL de Etanol
• Tapar bien y colocar sus viales en una gradilla. Llevar la gradilla a sonicarpor 15 minutos o hasta notar total disgregación de la materia. Luego llevar a un baño de agua a 80ºC por 15 minutos.
• Retirar del baño la gradilla con los tubos y dejar enfriar a temperatura ambiente.• Una vez frío centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos, idealmente a 4ºC.
Abrir cuidadosamente la tapa y adicionar 10 mL de la solución de NaCl al 3%.
• Adicionar 20 mL de n-Hexano.
•Sonicar por 10 minutos.
• Centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos, idealmente a 4ºC.
• Tomar una alícuota de 1 a 2 mL de la fase orgánica (fase superior) y dispensar a un vial con tapa de (NOTA: el vialdebe mantenerse refrigerado a -20ºC hasta realizar el análisis cromatográfico).





Determinación de colesterol por GC-FID.
• Los parámetros cromatográficos para la determinación son lossiguientes:
- T° detector: 300 °C
- T° inyector: 250 °C
- Gas carrier: Helio
- Split mode: Splitless
- Volumen de inyección: 1 μL.
- Lavado de jeringa con acetona y n-Hexano, al menos 3 veces cadasolvente, antes y después de la inyección.
• Programa de temperatura del horno:
*Inicialmente a 190 °C, mantener por 2 minutos.
*Aumentar la temperatura a razón de 20 °C por minuto hasta 230 °C ymantener
Por 3 minutos.
*Tiempo de post corrida de 0 minutos.
*Tiempo total de corrida: 33 minutos.



Solución estándar (ISTD) de 5α-colestano (solución madre de 2 mg/mL): pesar 200
mg de...