Amoramoramoar



PRACTICA I

Estudio de una actividad enzimática:
CBCC1




















Objetivos:

Evaluar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial de una reacción catalizada.Determinar los parámetros cinéticos (Km y V máx) de la invertasa de levadura.

No menos importante cabe aclarar que esta instancia la tomo como objetivo propio el aprender a utilizar correctamentelos instrumentos disponibles que ponen en nuestras manos el departamento de bioquímica. Y los cuidados a tener en cuenta a la hora de utilizarlos





Tabla 1: Actividad enzimática: Velocidad inicialen función de la concentración de sustrato.


Tubo
[Sacarosa] (mM)
Volumen Sacarosa 400 mM (µL)
Volumen Buffer (µL)
Volumen Invertasa* (µL)
B1
0
0
900
100
1
10
25
875
100
2
20
50
850
100
3
50
125
775100
4
100
250
650
100
5
300
750
150
100
6
360
900
0
100







Tabla 2: Curva de Calibración del DNS con glucosa.



Tubo
Glucosa 10nM (µL)
H₂O
(µL)
DNS
(Ml)
[Glucosa]
(mM)
ABS₅₇₀nm
(UA)
B
-
100
0,90
0,009
1
20
80
0,9
2
0,012
2
40
60
0,9
4
0,041
3
60
40
0,9
6
0,081
4
80
20
0,9
8
0,135
5
100
0
0,9
10
0,235




Glucosa (mM)

M2 = 10 mM x 0 µL / 100 µL = 0 Mm

M2 = 10 mM x 20 µL / 100 µL = 2 mM

M2= 10 mM x 40 µL / 100 µL = 4 mM

M2 = 10 mM x 60 µL / 100 µL = 6 mM

M2 = 10 mM x 80 µL / 100 µL = 8 mM

M2 = 10 mM x 100 µL / 100 µL = 10 mM








Resultado y datos correspondientes de la curvade calibración


El valor del coeficiente obtenido de extinción molar para el DNS reducido sería:
0,022 mMˉ¹ cmˉ¹.

La ecuación de la recta obtenida para la grafica:
y =0,022x - 0,0244












Tabla 3: Datos de la enzima

[sacarosa]
(mM)
Abs. A ₅₇₀nm
En 15 min
[Glu] en
15 min
Vo
[Glu]/min
0
0
0
0
10
0,063
1,432
0,095
20
0,035
0,795
0,053
50
0,244
5,5450,370
100
0,399
9,068
0,605
300
0,790
17,95
1,197
360
0,742
16,86
1,124



[S]= Abs / E. L
[GLU] = 0,063/ 0,022 x 1 = 2,864

[GLU] en 15 min
2,864/2=1,432

VO...