Amplificación Por Pcr Y Análisis De Restricción En Dunaliella Tertiolecta

Universidad de Concepción
Fac. Ciencias Naturales y Oceanográficas
Genética molecular y genómica












Laboratorio N° 2:

Amplificación por PCR y Análisis de Restricción en Dunaliella Tertiolecta





















Nombre: Zaira Musleh Vega
Fecha: 26 diciembre, 2011
Profesora: Patricia Gómez

INTRODUCCIÓN

La técnica de PCR (o Reacción encadena de la Polimerasa) es un método molecular de amplificación de ADN basado en las características de su estructura química y su replicación de tipo semiconservativa, empleando ciclos repetitivos de síntesis in vitro de DNA dirigido por un oligonucleótido iniciador (Torres, A., et al, 1995), o primer. Para realizar esta reacción se requieren ADN templado, que corresponde a la hebra molde, dospartidores, los cuadro dNTP (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), Taq polimerasa (enzima catalizadora de la reacción) y un tampón que contenga Mg2+, que es un cofactor requerido por la enzima.
Por otra parte, el de polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción o RFLP, es un método de biología molecular que permite seguir una secuencia particular de ADN. Así, RFLP es una secuencia de ADN con un sitiode restricción en cada extremo con una secuencia “objetivo”. En este tipo de análisis son utilizadas las regiones ITS (Internal Transcribed Spacer) que son regiones no codificantes que separan los componentes individuales de ADN ribosómico y muestran un polimorfismo mucho mayor que otras regiones, siendo útiles como fuente de marcadores genéticos. De esta forma, el polimorfismo será evidenciado porla diferencia en los patrones de digestión generados a partir del producto de PCR, los cuales se obtienen de mutaciones que pueden hacer desaparecer o aparecer nuevos sitios para la enzima.
En el siguiente practico serán utilizados para la amplificación de ADN por PCR los partidores AB28 y TW81, que se unen a regiones conservadas de los genes ribosomales, para así amplificar la región ITS queincluye ITS-1 e ITS-2, junto al gen de ARNr de 5.8S.
Además, para el análisis RFLP, que será realizado en una muestra de Dunaliella tertiolecta, microalga verde del orden volvocales, familia polyblepharidaceae, clase chlorophyceae que se caracteriza por ser unicelular, mótil, de forma bacilar con un tamaño que varía entre 9-11µm, y que habita en agua salada (Hall, J., Golding, L., 1998), seránutilizadas la enzima de restricción: HaeII, cuya secuencia de reconocimiento corresponde a 5’ GGCC 3’ CCGG.
De esta forma, el objetivo del siguiente trabajo práctico es:
- La amplificación de la región ITS en microalgas a través del método PCR, utilizando partidores específicos.
- Realizar un análisis RFLP en la región ITS de microalgas, utilizando digestión controlada con enzimas de restricción.- Realizar una curva de calibración que relaciones el tamaño en pares de bases con respecto a la distancia recorrida en el gel para el producto PCR.
- Determinar el tamaño de los fragmentos amplificados.


MATERIALES Y MÉTODOS

1. Amplificación de ADN por medio de PCR.
Se prepararon 25 µl un mix de amplificación constituido por la enzima Taq polimerasa ‘GoTaqFlexi’ (Promega), el tampón dereacción, MgCl2 (cofactor) y los 4dNTPs. Posteriormente, fue mezclado con una muestra de ADN molde de Dunaliella tertiolecta dentro de un tubo Eppendorf. Posteriormente, este mix fue separado en 3 tubos diferentes, los que fueron instalados en termociclador exponiendo la muestra a determinadas condiciones: por 5 min a 95°C; 5 ciclos de 1 min a 90°C; 2 min a 50°C; 1min a 72°C, luego a 30 ciclos de1min a 90°C; 1min a 60°C; 1min a 72°C; finalmente por 10min a una temperatura de 72°C.


2. Electroforesis en gel del producto PCR.
Se utilizaron 5µl de la muestra obtenida tras PCR, agregando 3µl de solución de siembra Green Flexi Buffer GoTaq, para sembrar en gel de agarosa, siendo utilizado el primer y último carril con 2µl y 4µl de marcador molecular Mass Ladder, respectivamente, mientras...