Análisis De Bases De Purinas Con Espectrometría De Masas Por Electrospray (Esi-Ms) Y Por Electroquímica Acoplado A Espectrometría De Masas Por Electrospray (Ec/Esi-Ms)

ANÁLISIS DE BASES DE PURINAS CON ESPECTROMETRÍA DE MASAS POR ELECTROSPRAY (ESI-MS) Y POR ELECTROQUÍMICA ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS POR ELECTROSPRAY (EC/ESI-MS)
Las purinas, incluidas la guanina, adenina, hipoxantina y la xantina (muestras analizadas en este trabajo), son bases nitrogenadas, compuestos orgánicos heterocíclicos. Todas son compuestas por un anillo aromático doble (anillopurina). Además de ser utilizadas en la síntesis de ADN y ARN las purinas son componentes importantes de varias biomoléculas, como el ATP, GTP, AMPc, NADH y Coenzima A.

Scheme 1. Structures of purine bases
Estos análisis son frecuentemente analizados con espectrometría de masas por electrospray. Electrospray (ES) es un método por el cual iones, presentes en una solución pueden ser transferidos ala fase de gas.
Sin embargo, procesos electroquímicos en la fuente de iones ES pueden aumentar la sensibilidad al detectar analitos con bajos potenciales de oxidación como las purinas nombradas anteriormente. Es decir las reacciones electroquímicas de purinas durante el modo de ion positivo ESI-MS pueden aumentar la sensibilidad y la selectividad en estos análisis.
Para realizar el acopleEC/ESI-MS se necesita integrar una celda electroquímica dentro del capilar que contiene el sistema utilizado para electrospray. Este esquema es mostrado en la figura 1.

Fig.1. Schematic of the EC/ESI MS system with the electrochemical cell integrated into the electrospray capillary
El espectro de masas ESI para la guanina preparada en una solución de 50/49 %vol. H2O/MeOH/HAc, con pH 4.2, semuestra en la fig. 2. En este espectro los picos observados con m/z 152 y m/z 303 se deben a aductos protonados [Gua + H]+ y el dímero de la guanina [2Gua + H], respectivamente. Y los picos con m/z 174 y 325 se deben a aductos [Gua + Na]+ y [2Gua + Na]+ de la guanina y el dímero de la guanina, respectivamente. El aducto [2Gua + K]+ también es observado en el pico con m/z 231. Sin embargo, cuando lacelda electroquímica EC es encendida se obtiene una señal para [(Gua-NH3)+H]+ m/z 135 como se muestra en la figura 3. En la fig. 4 se muestra como al ir aumentando lentamente el voltaje de la celda la intensidad de el dímero de la guanina decrece mientras que la guanina [Gua + H]+ y la guanina desaminada [Gua-NH3]+ aumentan su intensidad.
Cuando se utilizó la solución 40/60 %vol. H2O/MeOH, 1Mm NH4Ac,con un pH 6.3, se observan dos picos con m/z 627 y 643 correspondientes a tetrámeros de guanina unidas por puentes de hidrógeno, con un ión de Na+ (esquema 2) y un ion de K+ en el centro, respectivamente. Esto último se muestra en la fig. 5.

Fig. 2. The ESI MS of guanine (50µM) in 50/49/1 vol.%, H2O/MeOH/HAc, pH~4.2; HV 3 kV; flow rate 30µL/h.

Fig. 3. The EC/ESI-MS of guanine (50µM) in50/49/1 vol.%, H2O/MeOH/HAc, pH~4.2; HV 3 kV; flow rate 30µL/h.

Fig. 4. The EC/ESI MS of guanine (50_M). Other conditions as in Fig. 3.

Scheme 2. The H-bonded guanine tetramer with a metal ion center (M+ = sodium ion, Na+ or potassium ion, K+).

Fig. 5. The ESI MS of guanine (50µM) in 40/60 vol.%, H2O/MeOH, 1mM NH4Ac, pH~6.3; HV 3 kV; flow rate 50µL/h.

En el mecanismo que se muestra en elesquema 3, se muestra el proceso de oxidación de la guanina donde uno de los productos es la 8-oxoguanina [OxoGua-H]+, pero esta señal no es observada en el espectro de la fig. 5. En este mecanismo inicialmente hay una pérdida de 1 e-, 1 H+ que conduce a un radical dimérico que se estabiliza por transferencia átomo de hidrógeno a través de enlace de hidrógeno con una molécula de guanina sin oxidar.Un radical guanina neutro generado en este paso puede ser oxidado por la pérdida de 1e -, 1H+, seguido rápidamente por hidrólisis a 8-oxoguanine. Una vía alternativa de formación de dímeros es a través de puentes de hidrógeno, que es una vía común de formación de dímeros en ESI

Scheme 3. Proposed mechanism of oxidation of guanine in 50/49/1 vol.%, H2O/MeOH/HAc, pH∼4.2, during positive mode...