ANALISI DE AGAROFA



PROFESOR:
SALCEDO GUILLERMO


PRACTICA:
ANALISIS DE DNA EN ELECTROFORESIS DE AGAROSA


ALUMNOS:
ALTAMIRANO MORALES LESLIE ANAID
NUÑEZ CASTRO MARIA LUISA
ORTIZ PEREZ CINTIA JIMENA
MURILLO HUERTA GUSTAVO
COLIN MAGAÑA ITZEL ARACELI
FLORES VILLARREAL CRISTIAN ERICK


FECHA DE ENTREGA:
11/03/15
ANALISIS DE DNA EN ELECTROFORESIS DE AGAROSA
INTRODUCCION

Una de las técnicas generalmenteutilizadas para caracterizar ácidos nucleicos en bases a su forma y tamaño es la electroforesis de agarosa. La carga negativa de los fosfatos de DNA y RNA genera la migración de estas moléculas cuando se encuentran bajo el efecto de un campo eléctrico. La resistencia al movimiento generada por los poros del gel de agarosa y las sales de amortiguador harán que los fragmentos grandes migren menos comparadoscon los fragmentos de menor tamaño. La concentración de agarosa también es una variable que permitirá separar de la mejor forma fragmentos de tamaños distintos durante la electroforesis.
La concentración e integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN, pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consisteen la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro,haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis. La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo queaquellos de mayor tamaño. Al aumentar la concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel (Posso y Ghneim op cit.). Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa puedenvisualizarse mediante tinción con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleíco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sinembargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis. La técnica para la cuantificación de ADN consistesimplemente en la utilización de una secuencia de concentraciones de solución patrón de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentración desconocida. El cálculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta según la fluorescencia. Debe evitarse la exposición prolongada a la luz ultravioleta, incluso con máscara de protección. La estimación de las concentraciones de ADN puederealizarse sobre una fotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imágenes. La concentraciónón de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño del segmento de ADN que se quiera visualizar.

HIPOTESIS

En este procedimiento de electroforesis en gel de agarosa esperamos ver fragmentos de DNA en el gel generado por enzimas de...