Analisis De La Composición De La Cromatina
Páginas: 6 (1290 palabras)
Publicado: 1 de octubre de 2012
ANALISIS DE LA COMPOSICION DE LA CROMATINA
Objetivo general
Aprender a realizar técnicas de obtención de diferentes muestras de ADN y proteínas a partir de las células eucariotas para su posterior análisis utilizando métodos analíticos y cuantitativos.
Objetivos particulares
*Aprender el adecuado manejo para la obtención de las muestras (extractos de proteínas nucleares, citosólicasy AND genómico) y la manipulación del tejido para obtener un mayor rendimiento y preservación de las muestras.
* Aprender el armado y funcionamiento de la técnica separativa para proteínas, electroforesis en geles de poliacrilamida, y el posterior análisis de las diferentes muestras de proteínas sembradas.
* Aprender el armado y funcionamiento de la técnica separativa para las muestras de ADNobtenidas, y su posterior análisis mediante geles de agarosa.
Introducción
El ADN eucarionte se encuentra organizado en forma de cromatina, la cual se integra por estructuras elementales llamadas nucleosomas. Cada nucleosoma está compuesto por un corazón proteico octamerico (histonas) y ADN, el cual envuelve con dos vueltas a dicho corazón. Este último, también sirve como nexo entre dosnuecleosomas.
Se utilizaran como punto de partida, homogenado de timo de ternero debido a que las células que conforman este tejido se encuentran en constante división, y por ende el contenido de ADN por gramo de tejido es uno de los altos en mamíferos.
Método para la preparación de las muestras
Homogeneizamos en frio (para disminuir la actividad enzimática) una muestra de timo con medio dehomogenización, el cual rompe las membranas plasmáticas y acompleja los cationes divalentes (utilizando EDTA) que actúa en las enzimas, inhibiendo las funciones enzimáticas, y luego centrifugamos.
El sobrenadante contiene las proteínas citosólicas, mientras que el pellet se re suspendió con medio de lisis de núcleos, conteniendo este alta fuerza iónica y SDS.
Se tomo una alícuota de lasredisolución, se llevo a centrifuga y se separo el sobrenadante en el cual se obtuvieron las proteínas nucleares.
Luego, utilizamos cloroformo, en la fracción restante que fue redisuelta para la separación de proteínas de las moléculas de ADN. Posterior a esto, se agrega etanol en frio a la fracción recolectada con el ADN para provocar la precipitación y concentración del mismo. Por un lado, seobtuvo ADN de varilla (ADN I), el cual fue solubilizado nuevamente con previo secado a temperatura ambiente. Y por otro lado, para la obtención de ADN II se agito la solución con etanol frio para asegurar la post precipitación de todo el ADN.
Método para la determinación de proteínas
A través de un método colorimétrico de Sedmak y Grossberg, estimamos la concentración semicuantitativamente deproteínas en las muestras rotuladas como proteínas citosólicas y proteínas nucleares comparándolas con un patrón de BSA de concentración conocida.
Preparación del gel de poliacrilamida. Electroforesis de proteínas.
En la técnica electroforética SDS-PAGE las proteínas interaccionan con el detergente aniónico SDS (desnaturaliza a las proteínas sin romper los puentes disulfuro) formando complejoscargados negativamente, que enmascaran la carga intrínseca de la proteína de manera que solo sean separadas según sus diferencias de tamaño. Se agrega también un agente reductor β-mercaptoetanol, capaz de romper los puentes disulfuro y separar las proteínas en las subunidades que la conforman. Además las muestras son calentadas para asegurarse una completa desnaturalización de las proteínas.El excelente poder de resolución (es decir su capacidad de separación) de estos geles deriva del uso de un sistema de buffers discontinuo, en el cual el gel está separado en una primera parte concentradora y una segunda parte separadora, ambos de diferente pH. Las muestras se introducen en el sistema de pocillos.
Utilizamos este tipo de gel en condiciones desnaturalizantes ya que la gran...
Objetivo general
Aprender a realizar técnicas de obtención de diferentes muestras de ADN y proteínas a partir de las células eucariotas para su posterior análisis utilizando métodos analíticos y cuantitativos.
Objetivos particulares
*Aprender el adecuado manejo para la obtención de las muestras (extractos de proteínas nucleares, citosólicasy AND genómico) y la manipulación del tejido para obtener un mayor rendimiento y preservación de las muestras.
* Aprender el armado y funcionamiento de la técnica separativa para proteínas, electroforesis en geles de poliacrilamida, y el posterior análisis de las diferentes muestras de proteínas sembradas.
* Aprender el armado y funcionamiento de la técnica separativa para las muestras de ADNobtenidas, y su posterior análisis mediante geles de agarosa.
Introducción
El ADN eucarionte se encuentra organizado en forma de cromatina, la cual se integra por estructuras elementales llamadas nucleosomas. Cada nucleosoma está compuesto por un corazón proteico octamerico (histonas) y ADN, el cual envuelve con dos vueltas a dicho corazón. Este último, también sirve como nexo entre dosnuecleosomas.
Se utilizaran como punto de partida, homogenado de timo de ternero debido a que las células que conforman este tejido se encuentran en constante división, y por ende el contenido de ADN por gramo de tejido es uno de los altos en mamíferos.
Método para la preparación de las muestras
Homogeneizamos en frio (para disminuir la actividad enzimática) una muestra de timo con medio dehomogenización, el cual rompe las membranas plasmáticas y acompleja los cationes divalentes (utilizando EDTA) que actúa en las enzimas, inhibiendo las funciones enzimáticas, y luego centrifugamos.
El sobrenadante contiene las proteínas citosólicas, mientras que el pellet se re suspendió con medio de lisis de núcleos, conteniendo este alta fuerza iónica y SDS.
Se tomo una alícuota de lasredisolución, se llevo a centrifuga y se separo el sobrenadante en el cual se obtuvieron las proteínas nucleares.
Luego, utilizamos cloroformo, en la fracción restante que fue redisuelta para la separación de proteínas de las moléculas de ADN. Posterior a esto, se agrega etanol en frio a la fracción recolectada con el ADN para provocar la precipitación y concentración del mismo. Por un lado, seobtuvo ADN de varilla (ADN I), el cual fue solubilizado nuevamente con previo secado a temperatura ambiente. Y por otro lado, para la obtención de ADN II se agito la solución con etanol frio para asegurar la post precipitación de todo el ADN.
Método para la determinación de proteínas
A través de un método colorimétrico de Sedmak y Grossberg, estimamos la concentración semicuantitativamente deproteínas en las muestras rotuladas como proteínas citosólicas y proteínas nucleares comparándolas con un patrón de BSA de concentración conocida.
Preparación del gel de poliacrilamida. Electroforesis de proteínas.
En la técnica electroforética SDS-PAGE las proteínas interaccionan con el detergente aniónico SDS (desnaturaliza a las proteínas sin romper los puentes disulfuro) formando complejoscargados negativamente, que enmascaran la carga intrínseca de la proteína de manera que solo sean separadas según sus diferencias de tamaño. Se agrega también un agente reductor β-mercaptoetanol, capaz de romper los puentes disulfuro y separar las proteínas en las subunidades que la conforman. Además las muestras son calentadas para asegurarse una completa desnaturalización de las proteínas.El excelente poder de resolución (es decir su capacidad de separación) de estos geles deriva del uso de un sistema de buffers discontinuo, en el cual el gel está separado en una primera parte concentradora y una segunda parte separadora, ambos de diferente pH. Las muestras se introducen en el sistema de pocillos.
Utilizamos este tipo de gel en condiciones desnaturalizantes ya que la gran...
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