Analisis de proteinas

Método de Bradford
Los métodos de tinción de Bradford de fundamenta en la naturaleza anfótera de las proteínas.
Se basa en la unión de un tinte o colorante, azul brillante de Comassie G-250 a lasproteínas, provocando un cambio de coloración de rojo o azulado, por lo que le máximo de absorción del tinte se desplaza a 465 nm hasta 595 nm, este último cambio de absorbancia es directamenteproporcional a la concentración de proteínas de la muestra.
La solución acida de las proteínas debe estar por un pH por debajo del punto isoeléctrico de la proteína o proteínas de interés, el tinte añadidose une electrostáticamente. Se puede determinar las proteínas en productos como malta, cerveza y tubérculos de la patata.
Procedimiento
Se disuelve azul brillante de Comassie G-250 en etanol 95% yse acidula con ácido fosfórico 85%
Las muestras (1-1000 ug/ml) y diluciones patrones de BSA se mezclan con el reactivo de Bradford.
Se mide la absorbancia a 595 nm, frente a un blanco del reactivo yfinalmente se estima la cantidad de proteína a partir de la curva BSA.
Ventaja: Este método es sensible, simple, rápido, barato.
Desventaja: sustancias (detergentes y las soluciones básicas.)interfieren en su determinación.
Método BCA
Las proteínas reducen los iones cúpricos a iones cuprosos, bajo condiciones alcalinas.
El ion cuproso se acompleja con el reactivo BCA de color verde manzanapara dar lugar a un color purpura, la intensidad del color formado es directamente proporcional a la concentración de proteínas de la muestra. Es utilizado en la purificación y extracción de proteínasProcedimiento
Mezcla de las proteínas con el reactivo BCA, el cual contiene sal sódica del BCA, carbonato de sodio, NaOH y sulfato de cobre a pH 11.25.
Incuba a 37° C por 30 min o a T° ambiente por 2horas o a 60° C por 30 min. Las T° dependerá de la sensibilidad deseada.
Se toma la lectura de absorbancia a 562 nm frente a un blanco del reactivo y finalmente se realiza la curva de calibración...