analisis

Análisis de ácidos nucleicos

Cuantificación de DNA

1. Preparación de reactivos

NaCl 0.1 M (58.44 PM)

58.44 - 1M (1L)
X - 0.1 M = 5.844 g en 1 L

5.844 g – 1L
X -0.1 L = 0.5844 g de NaCl en 100 mL de agua destilada


Proteinasa K

20,000 ug proteinasa – 1000 uL solución
5 ug proteinasa - 0.25 uL solución

5ug proteinasa - 0.25 uL solución200 ug - 10 uL solución

10 uL proteinasa + 90 agua destilada  para estar en una concentración de 200 ug de solución stock – que serían 100 uL de solución  (una vez homogeneizada lamuestra) de esta solución de 200 ug de concentración  tomar 2.5 uL de solución de proteínasa y agregar a cada muestra

2. En un mortero, colocar la muestra y homogeneizar en 0.5 mL de NaCl 0.1 M

3.Digerir 2 hrs. A 55 °C con la proteinasa

4. Centrifugar a 13,000 g/10 min y tomar sobrenadante

5. Preparar PicoGreen (el PicoGreen es un fluoróforo que se une específicamente al DNA de doblecadena (dsDNA))

100 uL PicoGreen – 19.9 mL TE
X - 0.5 mL = 2.5 uL PicoGreen en 0.5 mL TE (solución stock, ajustar el Picogreen de acuerdo al volumen que se va a usar).6. En una placa negra preparar curva estándar (c/u por triplicado)

Blanco
---
10 uL NaCL
50 uL de PicoGreen
50 ng
0.5 uL std. DNA
9.5 “ ”
“ ”
100 ng
1 “ ”
9“ ”
“ ”
150 ng
1.5 “ ”
8.5 “ ”
“ ”
200 ng
2 “ ”
8 “ ”
“ ”
250 ng
2.5 “ ”
7.5 “ ”
“ ”
muestras
10 uLde muestra
---
“ ”


7. Leer muestras a 500nm de excitación y 535nm de emisión, la concentración de dsDNA (ng) se calcula con la curva estándar



Cuantificación de RNA

1. PrepararRiboGreen

100 uL RiboGreen – 19.9 mL TE
X - 0.5 mL = 2.5 uL RiboGreen en 0.5 uL de TE


2. En un tubo eppendorf

10 uL muestra  40 uL
2 uL enzima  8 uL
1...