Anexo

ANEXOS

ANEXO A.
CANTIDAD

CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE LA
DE

BIOMASA

(PESO

SECO

VS.

DENSIDAD

ÓPTICA)

Y

DETERMINACION DE BIOMASA

1. Después de realizar una fermentación completa del microorganismo se toma 1mL
por duplicado de una muestra en la fase de crecimiento estacionaria (a las 12
horas del cultivo). Esta muestra se centrifuga en tuboseppendorf a 14000 RPM y
4 ºC durante 20 minutos, se decanta el sobrenadante se lava 2 veces,
recentrifuga y decanta de nuevo. El pellet se resuspende en 1 mL de agua
desionizada y se lee absorbancia a 600 nm.
2. Se realizan las diluciones necesarias para obtener concentraciones conocidas
mediante la ecuación:

C1 * V1 = C 2 * V2

(11)

Donde:

C1 :

Concentración al final de lafermentación, que se tiene como
absorbancia

V1 :

Volumen a tomar

C2 :

Concentración a la que se quiere llegar

V2 :

Volumen total correspondiente a la C2 (5 mL)

3. Se lee la absorbancia de cada muestra a 600 nm, con agua desionizada como
blanco.
4. En un eppendorf previamente secado, rotulado y pesado, se toma 1 mL de las
muestras leídas, se centrifugan a las mismas condicionesdescritas en el numeral
1, se descarta el sobrenadante y se llevan a un horno a 50 ºC durante 24 h.
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5. Se dejan enfriar en el desecador y se pesan hasta peso constante
6. La cantidad de biomasa se calcula mediante la ecuación 12.

Cx =

X 2 − X1
VL

(12)

Donde:
Cx :

Concentración de la biomasa seca [g/L].

X1:

Peso de los eppendorf vacios y secos [g]

X2:

Peso delos eppendorf con biomasa seca o pellet [g]

VL :

Volumen del cultivo [L]

7. Se realiza una grafica peso seco Vs. absorbancia y se linealiza.

DETERMINACIÓN DE BIOMASA

1. Se toma por duplicado 1 mL de la muestra y se introduce en un tubo falcon de 15
mL.
2. Se llevan a centrifugación durante 20 minutos a 4500 RPM.
3. El sobrenadante es conservado para realizar las pruebas de consumode
sustrato y el pellet es resuspendido en 1mL de agua desionizada.
4. Posteriormente se repite el lavado de las células como se indica en el numeral 2
y 3 descartando el sobrenadante.
5. Al terminar el segundo lavado, se descarta el sobrenadante y se realiza una
dilución agregando al pellet 10 mL de agua desionizada.
6. Se lee la absorbancia a 600 nm, con agua desionizada como blanco. Estosvalores se relacionan con el peso seco mediante una curva de calibración. Para
obtener la concentración final debe multiplicarse por el factor de dilución.

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ANEXO B.

PREPARACIÓN

DEL

DNS,

CURVA

DE

CALIBRACIÓN

Y

DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES POR EL METODO DEL DNS

Pasos para preparar DNS:
1. Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada.
2. Adicionar 30 g detartrato de Na y K
3. Adicionar 1 g de DNS
4. Aforar a 100 mL con H2O destilada
5. Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC

Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg/mL y almacenarlo a 4 ºC.

A partir de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva
patrón con la siguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4.

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL MÉTODODEL DNS

1. Tomar 0.5 mL de cada dilución y agregar 0.5 mL de reactivo DNS.
2. Preparar una muestra blanco por dilución de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL
del reactivo de DNS.
3. Agitar todas las muestras.
4. Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos.
5. Enfriar con hielo.
6. Adicionar 5 mL de H2O destilada.
7. Agitar y dejar en reposo 15 min.
8. Leer a 540 nm.
9.Realizar la curva Absorbancia versus concentración. Debe tener un coeficiente
de correlación de 0.991 a 0.999.

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ANEXO

C.

DETERMINACIÓN

DEL

COEFICIENTE

VOLUMÉTRICO

DE

TRANSFERENCIA DE OXÍGENO POR EL MÉTODO DINÁMICO DE ELIMINACIÓN
DE GAS

El procedimiento consiste en suspender la aireación del reactor, lo cual resulta en un
decaimiento lineal de la concentración de...