Análisis de Actividad Enzimática

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA α-amilasa
INTRODUCCIÓN
¿Cómo se mide la actividad de una enzima?
Dada una reacción:
Enzima
Sustrato/s Producto/s

la actividad de la enzima puede evidenciarse ya sea detectando la aparición del producto o bien la desaparición del sustrato. Para esto pueden usarse tests colorimétricos, absorbancia de la luz de determinada longitud de onda, sustratosmarcados radiactivamente, etc., según convenga en cada caso.
Caracterizar la actividad de una enzima implica determinar cuáles son las condiciones óptimas para su actividad (pH, temperatura, etc.), cuál es la naturaleza química de la enzima, si puede ser activada o inhibida y cómo, etc.
En este TP, estudiaremos la enzima α-amilasa. La α-amilasa es una enzima que degrada el almidón, principalpolisacárido de reserva de las plantas. Como vemos en la figura, el almidón está compuesto por dos tipos diferentes de moléculas: amilosa y amilopectina. Ambas tienen como monómero la glucosa (Glu). La amilosa está formada por largas cadenas de glucosa, donde el C1 de una glucosa está unido al C4 de la siguiente. Son cadenas lineales y se arrollan en forma helicoidal. La amilopectina está formada porcadenas de glucosa unidas en C1 con C4 (como la amilosa) pero con múltiples ramificaciones (uniones C1 con C6). En el almidón aproximadamente un 15- 35% del peso corresponde a la amilosa y un 65-85% a la amilopectina.

AMILOSA
La α-amilasa rompe uniones entre los carbonos C1 y C4 de dos glucosas. Por lo tanto, usando almidón como sustrato, libera como productos dextrinas lineales y ramificadas.Las dextrinas son oligosacáridos compuestos, en este caso, por unas pocas unidades de glucosa.

AMILOPECTINA
En este TP, para medir la actividad de la α-amilasa, vamos a usar un conocido test colorimétrico que permite revelar la presencia de almidón en una solución. Por lo tanto, vamos a seguir la reacción detectando la desaparición del sustrato. El almidón en presencia de una solución deiodo (I) presenta una coloración azulada debido a la interacción física entre el iodo y las moléculas de amilosa. Cuando la –amilasa degrada el almidón, elimina la propiedad de la amilosa de interactuar con el iodo y, por lo tanto, de presentar coloración azulada.
Dado que el I2 es muy poco soluble en agua, para aumentar su solubilidad se lo mezcla con el anión ioduro (I-), obteniéndose tri-ioduro,el cual, por estar cargado, es más soluble en agua:
I2 + I- I3-
A esta mezcla se la conoce como solución de Lugol y es una solución 1% de iodo diatómico (I2) en equilibrio con de ioduro de potasio (KI) 2% en agua destilada. Fue nombrada en honor al médico francés Jean Guillaume Auguste Lugol.
OBJETIVO
Estudiar la actividad enzimática de la α-amilasa salival y caracterizar dicha actividad.DESARROLLO DEL TP
1) Recolección de la saliva
Un voluntario de cada grupo recolecta una muestra de saliva (2-3 ml) en un vaso de precipitado pequeño. Se mide el pH de la misma con papel indicador y se anota.
2) Dilución óptima y tiempo de referencia
Enzima: Diluir la saliva en un tubo de ensayo, según indicación del docente. Tapar el tubo con tapón de goma y mezclar por inversión suave variasveces (No agitar!). Determinación de la actividad enzimática Preparación del sustrato: Los docentes entregarán a cada grupo 1 tubo de ensayo con 10 ml de solución neutra (pH 7) de almidón 1% (m/v). Colocar el tubo en un baño térmico a 37°C durante por lo menos 2 min. Reacción enzimática: Manteniendo el tubo con el almidón (sustrato) a 37°C, agregarle 1 ml de la saliva diluida (enzima), tapar contapón de goma y mezclar por inversión. Llamamos a esto “t=0” o “tiempo cero” (momento en que comienza la reacción) por lo que en el momento de agregar la saliva otro integrante del grupo comienza a cronometrar. Colocar inmediatamente el tubo en el baño a 37°C y mantener allí hasta el final del experimento. Test colorimétrico para revelar la actividad enzimática: Retirar del tubo (sustrato +...