Análisis de la expresión y actividad antimicrobiana de apolipoproteína a-i de trucha arcoiris (oncorhynchus mykiss).

Análisis de la expresión y actividad antimicrobiana de
apolipoproteína A-I de trucha arcoiris (Oncorhynchus
mykiss).

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INDICE DE CONTENIDOS
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INDICE DE CONTENIDOS
INDICE DE FIGURAS
INDICE DE TABLAS
LISTA DE ABREVIATURAS
1. RESUMEN
SUMMARY
2. INTRODUCCIÓN
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
3.1.1 Reactivos
3.1.2 Equipos
3.2 Métodos
3.2.1 Animales de experimentación3.2.2 Inmunohistoquímica
3.2.2.1 Obtención de las muestras
3.2.2.2 Deshidratación y bloqueo
3.2.2.3 Incubación con antisuero específico anti-apoA-I de
trucha
3.2.2.4 Incubación con IgG anti-IgG de conejo conjugada
con fosfatasa alcalina
3.2.2.5 Revelado, hidratación y montaje
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3.2.2.6 Captura de imágenes
3.2.3Transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la
polimerasa (RT-PCR)
3.2.3.1 Obtención de las muestras
3.2.3.2 Purificación de RNA total (Método de Trizol)
3.2.3.3 Purificación de mRNA a partir de RNA total de
hígado y branquias
3.2.3.4 Cuantificación de RNA
3.2.3.5 Verificación de la integridad de los RNAs
3.2.3.6 RT-PCR
3.2.3.7 Visualización del producto del RT-PCR
3.2.4Purificación de proteínas
3.2.4.1 Obtención de plasma de carpa y trucha
3.2.4.2 Purificación de HDL mediante cromatografía de
afinidad
3.2.4.3 Purificación de apoA-Ι y apoA-ΙΙ mediante
cromatografía de filtración en gel
3.2.4.4 Determinación de concentración de proteínas por el
método de Bradford modificado
3.2.5 Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturantes
(PAGE-SDS) yelectrotransferencia
3.2.5.1 PAGE-SDS
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3.2.5.2 PAGE-SDS Tris-Tricina
3.2.5.3 Electrotransferencia
3.2.5.4 Western blot
3.2.6 Ensayos de actividad antimicrobiana
3.2.7 Análisis del efecto de Tris-EDTA en el ensayo
antimicrobiano
3.2.8 Análisis de integridad de apoA-I luego de ensayo
antimicrobiano
3.2.9 Digestión parcial de HDL conquimotripsina
3.2.10 Análisis de predicción de la estructura secundaria de
apoA-I de trucha
3.2.11 Modelaje de estructura terciaria de apoA-I de trucha
4. RESULTADOS
4.1 Inmunohistoquímica
4.2 Detección de apoA-I en el mucus de trucha
4.3 Análisis de la expresión del gen que codifica para apoA-I por RTPCR
4.4 Purificación de proteínas
4.4.1 Purificación de HDL
4.4.2 Purificación de apoA-I
4.5Comparación de perfiles electroforéticos de plasma y HDL de
carpa y trucha
4.6 Actividad antimicrobiana de HDL y apoA-I de trucha
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4.7 Efecto de EDTA a las concentraciones usadas en ensayo
antimicrobiano
4.8 Estabilidad de apoA-I de trucha durante ensayo antimicrobiano
4.9 Estructura secundaria de apoA-I de trucha4.10 Modelaje de estructura terciaria
4.11 Cinética de digestión de HDL de trucha con quimotripsina
5. DISCUSIÓN
6. BIBLIOGRAFÍA
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INDICE DE FIGURAS
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Figura 1
Inmunohistoquímica de apoA-I en epitelios y mucosas de trucha 38
Figura 2
Inmunodetección de apoA-I en tejidos hematopoyéticos y otros tejidos de trucha 39
Figura 3
Detección de apoA-I en elmucus de trucha 41
Figura 4
Análisis de la expresión del gen que codifica para apoA-I por RT-PCR en epitelios y
mucosas de trucha
43
Figura 5
Análisis de la expresión de apoA-I por RT-PCR a partir de RNAs totales de tejidos
hematopoyéticos y otros tejidos de trucha
44
Figura 6
Análisis de la presencia de inhibidores de la reacción de RT-PCR en muestras de
branquias y mucosa bucal
46Figura 7
Purificación de HDL de trucha por cromatografía en Cibacron Blue-agarosa (Affi-
Gel® Blue-Gel)
48
Figura 8
Purificación de apoA-I por cromatografía de filtración en Sephacryl S-200 49
Figura 9
vi
Comparación de perfiles electroforéticos de plasma y HDL de carpa y trucha 51
Figura 10
Efecto de EDTA sobre la viabilidad de Y. ruckeri en el ensayo antimicrobiano 57
Figura 11...