Análisis de PCR-RFLP de la región ITS del cistrón ribosomal nuclear en cepas de la microalga verde Dunaliella.






Análisis de PCR-RFLP de la región ITS del cistrón ribosomal nuclear en cepas de la microalga verde Dunaliella.






Nombre: Flavio Valdebenito

Ramo: Genetica Molecular y Genomica1. INTRODUCCION


El alga unicelular del genero Dunaliella, pertenece a las Clorofitas (algas verdes) incluida también en la clase Clorofícea. El género Dunaliella consiste en dos subgéneros, Pascheria (incluye cinco especies de agua dulce) y Dunaliella (incluye 23 especies descritas para agua marina) (Guiry y Guiry, 2008). Las algas de este género Dunaliella salina sonlas micro algas más estudiadas a nivel de su producción de biomasa (Borowizka y Borowitzka, 1988a) y son usualmente empleadas como fuente de alimento en la acuicultura (Spectorova et al., 1982; Artiles et al., 2001). Dunaliella salina se cultiva por tres propósitos comerciales como: obtención de biomasa, producción de glicerol y producción de carotenoides, principalmente el β-caroteno (Borowitzkay Borowitzka, 1988a; Raja et al., 2007). Excelentes adaptaciones a las condiciones ambientales del cultivo han contribuido a su gran aprovechamiento, la mayoría de las explotaciones comerciales de D. salina son realizadas en exteriores para aprovechar la luz natural y terrenos no aptos para la acuicultura. De esta forma se ha logrado una alta y estable producción de los mismos en condiciones decultivo introduciendo factores de estrés lumínico o nutricional (Orset Young, 2000).
En este trabajo se caracterizaron 7 cepas de Dunaliella, de las cuales cuatro eran de (D.salina), tres de (D. tertiolecta) y una de (D. viridis) La región del genoma que se estudió mediante amplificación por PCR en todas las cepas fue la Región ITS ( ITS1-5.8S-ITS2 ARNs), región donde se detecta la variabilidadintra e inter específica y secuencias conservadas de las diferentes cepas, de las cuales se definen comparaciones taxonómicas y de filogenia molecular grados de similitud o discordancia entre ellas. Por último se analizó la presencia de polimorfismo genético en la región ITS en las diferentes cepas, evidenciando este polimorfismo por las diferencias en los patrones de digestión del producto de PCRa través de enzimas de restricción (AluI y HhaI). Este tipo de análisis se conoce por el nombre de RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción).


OBJETIVOS GENERLES

-Analizar genéticamente a diferentes cepas de Dunaliella y realizar caracterizaciones intra e inter especifica entre ellas.



OBJETIVOS ESPECIFICOS

-Realizar el análisis genético de la Región ITSpara evidenciar presencia de polimorfismo genético en las diferentes cepas mediante análisis de restricción RFLP.



2. MATERIALES Y METODOS
2.1 Material biológico

Para este estudio se emplearon siete cepas de Dunaliella cuatro de ellas pertenecientes a D. salina de diferentes lugares geográficos (Chile, Perú, México), tres pertenecientes a D. tertiolecta (Australia, Dinamarca, Noruega)y la última corresponde a D. viridis (Chile). Las cepas son mantenidas en la colección biológica del Laboratorio de Micro algas Ficolab del departamento de Botánica de la Universidad de Concepción. Por último la cepa a evaluar en este trabajo es D. salina del Perú en comparación a las otras seis.

2.2 Caracterización Genética y Molecular

Las cepas de Dunaliella fueron caracterizadas a nivelgenético para corroborar su identidad. Para lo anterior se emplearon los oligonucleótidos TW81 y AB28 (Goff et al., 1994) que amplifican la región ITS que incluye el gen ribosomal 5.8s. Estos oligonucleótidos han sido empleados con éxito para identificación molecular de cepas del genero Dunaliella (González et al., 1999).


2.2.1 Extracción de ADN

Se realizó utilizando el típico...