Aplcacion de la genetica

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En la técnica de western blot se analiza la información sobre el tamaño y la cantidad de una proteína mutante en extractos celulares de pacientes con transtornos genéticos específicos. Las proteínas de un extracto celular se separan en función de su tamaño mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfieren a una membrana. A continuación, se incuba la membrana conanticuerpos específicos para esa proteína. Para detectar la interaccion proteína-anticuerpo se usa un segundo anticuerpo (contra el primer anticuerpo) marcado con un tinte fluorescente o una sustancia radiactiva. El western blot se usa para detectar la presencia o ausencia y el tamaño de la distrofina (una proteína muscular) en pacientes con distrofia muscular ligada a X.
Técnicas
• Transferencia delas proteínas a la membrana.
• Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos.
• Lavado de la membrana.
• Anticuerpos primarios y secundarios.
• Marcaje de anticuerpos.
• Sustratos cromogénicos.
• Sustratos quimioluminiscentes.
• Captura de los datos.
• Marcadores de peso molecular.
• Lavado y redetección de una membrana.
• Técnicas relacionadas.
Detección en el propio gel.
Far-WesternBlot Detection.
• Productos.
• Soporte.
Introducción.
El término “blotting” hace referencia a la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma. Este proceso es necesario ya que todas estas macromoléculas están embebidas dentro de la matriz que forma el gel, lo que imposibilita realizar su detección, mientras queen la membrana, se encuentran accesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma.
La técnica del Western Blot (también llamado “inmunoblotting” debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el antígeno o los antígenos específicos de interés) fue descrita por primera vez por Towbin et al. En 1979 y en la actualidad es una técnica de rutina en todos los laboratorios que realizananálisis de proteínas. La especificidad de la unión antígeno – anticuerpo permite la detección de una única proteína dentro de una mezcla compleja de otras proteínas. En la actualidad se utiliza como criterio de identificación positivo de una proteína especifica en una mezcla compleja y para obtener datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.
El primer paso de todo Western Blot es laseparación de las macromoléculas mediante geles de electroforesis; después de la misma, las macromoléculas ya separadas en función de su diferente peso molecular se transfieren a una segunda matriz, generalmente una membrana de nitrocelulosa o PVDF. Posteriormente, se bloquea la membrana para evitar la unión inespecífica a su superficie de los anticuerpos que se van a utilizar para la detección de laproteína de interés. En el siguiente paso, se une a dicha proteína transferida un anticuerpo especifico marcado con una enzima y, finalmente, se añade un sustrato apropiado para dicha enzima con lo que se produce un producto detectable como, por ejemplo, un precipitado cromogénico o fluorogénico en la membrana. En la actualidad, los métodos más sensibles emplean sustratos quimioluminiscentes quecuando se combinan con la enzima correspondiente, producen luz como producto final, que puede detectarse mediante una película o una cámara CCD. En todos los casos y sea cual sea el sustrato que se utilice, la intensidad de la señal se correlaciona con la cantidad del antígeno en la superficie de la membrana.

Método directo de detección: el anticuerpo primario marcado se une al antígeno de lamembrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable.

Método indirecto de detección: el anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato.
En el método directo de detección, el anticuerpo primario que se utiliza para detectar el antígeno sobre la superficie de la membrana, debe ir...