Aplicaciones-PCR-Extraccion y purificacion de los acidos nucleicos

Aplicacion PCR

Extracción y purificación de los ácidos nucleicos.

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Extracción y purificación de los ácidos nucleicos
Todos los tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común que va a permitir el desarrollo de un método de separación
especifico para ellas. Estos métodos deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser posteriormente útiles alinvestigador y, al
mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molécula deseada de entre un mezcla compleja de
multicomponentes que hacen las veces de “contaminantes” de nuestra molécula en cuestión. En este sentido, la cromatografía en columna ha
demostrado ser una herramienta muy útil ya que se dispone de varios mecanismos de separación. La modificación de lasdiferentes fases
estacionarias ya existentes, así como el desarrollo de nuevas es la base principal para la obtención de las condiciones necesarias para la rápida
y eficiente separación de biomoléculas.
• Cromatografía de penetrabilidad. El componente básico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partículas
de un polímero orgánico de estructura tridimensional, queoriginan una red de poros hidrofílicos equilibrados con un tampón acuoso. La
técnica consiste en que las moléculas de gran tamaño no penetran por los poros del polímero, por lo que migran mucho más rápidamente
que las de menor tamaño que sí son capaces de penetrar por los poros de la matriz.
Al principio del desarrollo de la técnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el rango deaplicaciones estaba restringido debido a los
elevados tiempos de separación y su poca resolución. En la actualidad se han desarrollado matrices de sílica estables a elevadas presiones
que se utilizan columnas de alta presión, para la separación de biomoléculas en función de su forma y tamaño.

• Cromatografía de intercambio iónico. Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. Elmecanismo básico es el
intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada
resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente,
pero eluirá de la columna al cambiar el pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones deltampón de elución interaccionan con los
grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas
positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga
negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

03.2006www.cultek.com

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Una modificación de este método es la extracción en fase sólida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en
columnas de polipropileno. La unión se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elución se va
incrementando laconcentración de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de
unión y se obtienen una rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos (DNA y/o RNA).

• Cromatografía de adsorción. Se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo
condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertosde una capa hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del
DNA en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de
agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA.
Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen...