Apoptosis por terapia fotodinamica (discusion)

Bid es un requisito para la inducción de apoptosis por terapia fotodinámica con un fotosensibilizador orientado a lisosomas pero no a mitocondria.

La terapia fotodinámica (PDT) mata a la célula por la creación de ROS cuando los fotosensibilizadores son activados por luz en presencia de oxigeno, el daño se presenta donde los fotosensibilizadores se concentran, estos se diseñan para orientarsea diversas estructuras celulares.
Dependiendo de la terapia, fotosensibilizador y tipo de célula la muerte se induce o no por apoptosis.
La fototerapia con sensibilizadores orientados a mitocondria y R.E. dañan las proteínas antiapoptóticas bcl2 y bclxl e inducen apoptosis por la liberación de citocromo c.
Se demostró que el fotosensibilizador NPe6 se une a lisosomas libera a bid e inicia lavía mitocondrial de apoptosis, pero con una cinética mas lenta respecto al caso de la terapia fotodinámica orientada a mitocondrias. Con esto se presumió que la vía mitocondrial es activada por una proteína t-bid la cual es activada por la caspasa 8. Sin embargo las proteasas de extractos lisosomales difieren en los sitios de unión a bid de los de la caspasa 8 y no son capaces de activar la cascadade caspasas.
Posteriormente se estudio el efecto de NPe6 en células de adenocarcinoma de pulmón humano en las cuales se silencio el gen BID y se encontró que se hacían resistentes a la PDT, además se demostró que la liberación de BID dependía de catepsinas y no de caspasa 8. Sin embargo aun no es claro que tan importante es la amplificación de BID para la vía apoptótica mitocondrial respecto aotros fotosensibilizadores lisosomales.
El equipo estudio el fotosensibilizador Pc4 que se une a mitocondria y R.E. y con la fotoirradiación induce la apoptosis. Pc181 es un fotosensibilizador que se une a lisosomas y comparado con Pc4 se une más y mata más células de la línea de cáncer de seno MCF7, sin embargo la inducción de apoptosis es mas lenta comparado con Pc4.

El objetivo del trabajoes elucidar el efecto del daño fotolisosomal en la muerte celular y descubrir el rol de BID en la activación de la vía apoptótica mitocondrial en las PDT.
Para ello se compararon Pc4 y Pc181 en cuanto su habilidad de inducir apoptosis en protocolos de PTD con células de fibroblasto de embrión de murino (MEFs) que expresen BID (bid+/+) y células que no lo expresan (bid-/-).

Los datos indican quebid es necesaria para la muerte celular en la PDT orientada a lisosomas pero no es necesaria para la PDT orientada a mitocondria.

Materiales y métodos
Líneas celulares MEFs wild-type (Bid+⁄+) y Bid knock-out (Bid- ⁄-)
Fotosensibilizadores Pc4 y Pc181
Mitotracker green (MTG), Oregon green dextran (OGD), naranja de acridina (AO)
Anti-Bax, anti-Bak, anti-Bid, anti active caspase 3,anti-actina, anti citocromo c de ratón anti-IgG ratón, Ac. Sec. acoplados a peroxidasa


PDT: se exponen los cultivos con el fotosensibilizador de 16-18h a luz roja 672nm a Temp ambiente, luego se incuban en oscuridad a 37ºC.
Microscopia confocal
Cuantificación de Pc181 y cantidad de DNA por citometría de flujo
Viabilidad celular: azul de tripano y 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyl-tetrazolium bromide
Determinación de citocromo c: Tinción inmunohistoquimica
Determinación de potencial de membrana: entrada de JC-1 (5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-
tetraethyl-benzimidazolyl-carbocyanine iodide)
Western blot

Resultados



Pc4 se une a mitocondria y RE de MEF, lo que se comprueba por la superposición parcial de PC4 y MTG colorante especifico a mitocondria, en contrastePc4 no se colocaliza con ODG, especifico para lisosomas.
Pc181 no colocaliza con MTG pero si con ODG.
No hay diferencias significativas en la fluorescencia de Pc4 y Pc181 en MEFs Bid(+/+) y (-/-)


Se comprueba la ausencia de bid en MEfs bid(-/-) por western blot usando de control Bak, actina y bax
Bak y bax son efectores apoptoticos y se encuentran en cantidades iguales en ambos tipos de...