Arginasa

Estudios de Purificación y Propiedades Cinéticas de Arginasa de Hígado de Rata

Resumen
Arginasa es una enzima implicada en la última etapa del ciclo de la urea, actuando sobre arginina(Arg) para formar ornitina y urea como productos( proceso dependiente de Mn+2). Con el fin de determinar las propiedades de dicha enzima, se extrajo la arginasa desde un macerado de hígado de rata,purificándose con sulfato de amonio y métodos de separación cromatográficos, para luego proceder a analizar parámetros de estabilidad de la enzima, tales como co-factores, interferentes, pH óptimo, entre otros. Además de esto, se efectuó el estudio de parámetros cinéticos de la enzima obteniendo valores para Km y Vmax de ….. mM y …….. respectivamente. Aquellos resultados irían acorde a laspropiedades esperadas de la Arginasa de acuerdo al rol regulatorio que cumpliría en el hígado de mamíferos y otras especies de animales.

Introducción

La enzima Arginasa se encuentra solo en los organismos ureolíticos y desempeña un rol fundamental en la síntesis de urea en el hígado.
La arginasa es una enzima presente en el hígado que participa en el ciclo de la urea y cataliza la degradaciónde la L- arginina en ornitina y urea. La arginina es formada a partir de glutamato en el citoplasma del hepatocito luego de una serie de reacciones enzimaticas1. En el ciclo de la urea, se agregan 2 grupos aminos, el primero se realiza en la mitocondria del hepatocito a partir de ornitina, la segunda, se realiza a partir de la arginosuccinato para formar arginina liberando fumarato, luego deesto actúa la Arginasa catalizando la siguiente reacción:

La actividad de la enzima fue determinada midiendo la formación de uno de sus productos, la urea, la cuál reacciona con el α- isonitroso propiofenona dando un compuesto coloreado , el cuál es determinado mediante absorciometría, en el caso de la concentración de la proteína , se utilizó en método de Bradford.
En el presente, se midela actividad de la enzima en presencia de inhibidor, en este trabajo se utilizó Ornitina, la cuál presenta una inhibición de carácter no competitivo.

Otro parámetro a medir, son los factores que afectan los parámetros cinéticos de la reacción, tales como el efecto del, pH, logrando obtener un valor
básico, también fue estudiado la actividad en relación a cofactores, tales como manganeso,magnesio, calcio, cobre, cobalto, níquel, y zinc. Los resultados obtenidos avalan el hecho de que la arginasa actúa con manganeso, siendo este su cofactor en la especie humana.
Otro estudio a realizar, fue la precipitación de las proteínas con sulfatos de amonio, en una primera etapa al 30% donde las proteínas se encontraban en el sobrenadante luego de la centrifugación, se midió su actividad. Enuna segunda instancia se realizó una precipitación al 70%, luego de la cuál, la concentración de proteínas se encontraban en el precipitado. Se mide actividad. Posteriormente se lleva a diálisis para luego pasar la muestra sobre una columna de intercambio iónico, se utilizó tanto intercambio catiónico como aniónico, siendo la arginasa eléctricamente positiva.

Materiales y métodos

Obtenciónde macerado de
hígado de rata
Una determinada cantidad de hígado de rata se pesó y trozó en una placa sobre hielo. Para su homogenización los trozos de hígado se colocaron en un mortero agregándoles 20 mL de tampón de lisis, se molieron hasta la obtención de una pasta fina, la que se centrifugó a 2000 rpm por 5 min. y se separó el sobrenadante por filtración a través de una lana de vidrio. Elfiltrado obtenido se calentó a 60 °C durante 10 min. y se centrifugó a 12000 rpm por 15 min. Se tomaron alícuotas del sobrenadante para los posteriores ensayos.

Determinación de actividad enzimática y Cuantificación de proteínas
El método utilizado para determinar la actividad de la arginasa se basó en la cuantificación de la urea producida, la que reacciona con el reactivo α- isonitroso...