ARN y RT-PCR

RT-PCR

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR del inglés Reverse transcription polymerase chain reaction) es una variante de PCR, técnica de laboratorio comúnmente usada en biología molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso llamado "amplificación". En la RT-PCR, donde una hebra de ARN es retrotranscripta en ADN complementario (ADNc)usando una enzima llamada transcriptasa reversa, y el resultado, se amplifica en una PCR tradicional.
La amplificación exponencial mediante PCR en Transcripción Reversa es una técnica altamente sensible, que puede detectar un número pequeño de copias de ARN. Una de las características más importantes es que en el proceso de RT-PCR, el ADNc generado ya no lleva los intrones que sí tendría el ADNoriginal. De este modo, al expresar el producto de ADNc de la RT-PCR, se generará un ARNm formado exclusivamente por exones. Esto permite darle a esta técnica uno de sus usos más importantes: insertar genes eucariotas en organismos procariotas.
En 1975 se concedió el Premio Nobel de Medicina o Fisiología a tres investigadores: Temin, Baltimore y Dulbecco, por «sus descubrimientos sobre lainteracción entre los virus tumorales y el material genético de la célula». Temin y Baltimore habían descubierto simultáneamente, aunque de forma separada, la transcriptasa reversa (RT), la enzima que puede transcribir ARN en ADN (ver figura 1), mientras que Dulbecco se centró en las interacciones entre los poliomavirus oncogénicos y la célula.

Figura 1. Representación esquemática de los eventos quesuceden tras la infección de un retrovirus y las enzimas que intervienen.
El descubrimiento de la RT ha producido un gran impacto en muchos aspectos de la ciencia. La posibilidad de formar ADN a partir de ARN ha permitido crear librerías de ADNc, lo que ha facilitado la clonación y el estudio de genes implicados en todas las facetas de la biología. También se ha producido una explosión deinvestigación en retrovirus, lo que ha demostrado ser crítico al descubrirse que el VIH es un retrovirus o el virus de la influenza. Ha permitido mejorar las técnicas de diagnóstico molecular a través de PCR de aquellos virus que poseen ARN como material genético. Otro de sus usos se relaciona con la cuantificación de la expresión génica, mediante la combinación de esta técnica con el análisis de Northernblot. Para llevar a cabo la metodología es indispensable obtener el ARN de las células en estudio, por lo que la metodología inicia con la obtención del ARN.

Pasos para realizar RT-PCR
1. Obtención del ARN
2. Convertir el ARNm a ADNc con la enzima Transcriptasa Reversa
3. Amplificar mediante una PCR un gen de interés usando el total de ADNc obtenido como templado (ver figura 2).
Figura 2. Lareacción en cadena de la polimerasa transcriptasa (RT-PCR) sirve para determinar si un tipo particular de ARNm está presente. En primer lugar, el ARNm de una muestra pequeña se convierte en ADNc de doble cadena utilizando las enzimas transcriptasa reversa y RNasa H. Un oligonucleótido se añade a la de ADNc y la segunda cadena se completa utilizando ADN polimerasa termoestable de T. aquaticus (Taqpolimerasa). Este ADN "blanco" es entonces desnaturalizado y se añaden dos conjuntos de oligos; estos se hibridan con los extremos opuestos de la secuencia blanco si la secuencia está presente.
Aislamiento de ARN
La obtención de ARN limpio e integro es esencial para obtener un buen rendimiento de transcritos, para clonar ADNcs intactos y para realizar un análisis funcional del metabolismo delARN. Una de las dificultades más importantes en el aislamiento de ARN es la presencia de ribonucleasas responsables de la degradación de esta molécula, las cuales son enzimas muy estables y activas que no requieren cofactores para funcionar. Una de las fuentes principales de contaminación con este tipo de enzimas proviene de las manos del experimentador, de hongos y bacterias del medio...