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ESPECTROFOTOMETRIA
DETERMINACIONES CUANTITATIVAS DE CROMÓFOROS
La espectrofotometría o absorciometría de UV-visible es la técnica más usada
en ciencias biológicas para efectuar determinaciones cuantitativas. Se diferencia
entre determinaciones cuantitativas directas y determinaciones cuantitativas a
través de un ensayo o test. En una determinación directa se mide la absorbancia
delcompuesto a determinar, el cual debe ser un cromóforo.
Las determinaciones cuantitativas directas se pueden efectuar por dos
diferentes métodos:
i) Cálculo de la concentración de la muestra a partir de su absorbancia (AM) y el
coeficiente de extinción molar de la literatura. Como en este método no se
requiere un estándar constituye una “determinación absoluta”.
ii) Determinación usando una curva decalibración: se construye la curva de
calibración usando una solución estándar del compuesto y se interpola en la
curva con AM o alternativamente se mide la pendiente de la recta (factor de
calibración k) y se calcula la concentración de la muestra usando AM y k.
En el presente práctico se determinará la concentración de una solución de
permanganato de potasio por los dos métodos señaladosanteriormente. El
permanganato de potasio en solución acuosa presenta una banda de absorción
ancha, provista de hombros, cuyo máximo se encuentra a 525 nm (ε = 2.500
M-1cm-1). Se obtendrá además una segunda curva de calibración, a una longitud
de onda diferente a la del máximo de absorbancia, con el objetivo de compararla
con la primera curva. Las curvas de calibración permitirán determinar sise cumple
la ley de Lambert- Beer para este cromóforo, en las condiciones usadas. Por otra
parte se podrá comparar el valor del coeficiente de extinción molar obtenido
experimentalmente a 525 nm con el valor de la literatura.

INSTRUCCIONES GENERALES PARA ESPECTROFOTOMETRIA
Los espectrofotómetros de la sala de trabajos prácticos del Instituto de
Bioquímica corresponden al modelo Evolution60 de la marca Thermo Scientific.
Estos espectrofotómetros operan entre 200 y 1100 nm (tienen una fuente de luz
de xenon) y permiten medir absorbancia, %T o concentración. El ancho de banda
de la luz usada es de 1 nm. La escala de A abarca desde -0,1 hasta 3,0. Para
medir concentración es necesario introducir previamente un factor de calibración.
Por otra parte, los instrumentos permitenejecutar ciertas funciones en forma
automatizada, como obtener espectros de absorción y realizar cinéticas. Los
instrumentos tienen alternativamente un portacubetas para una sola cubeta con
termorregulación eléctrica (Peltier) o un portacubetas para 6 cubetas sin
termorregulación. Todos los instrumentos tienen una pequeña impresora
incorporada.

Uso de las cubetas
En los prácticos deespectrofotometría se usarán solamente cubetas plásticas,
sin embargo en estas instrucciones se incluyen también las cubetas de cuarzo que
se usarán en otros trabajos prácticos.
a)
b)

No toque las paredes ópticas de las cubetas.
Manipule las cubetas de cuarzo con el máximo de cuidado. Precio de un par
de cubetas de cuarzo: 300 dólares

c)

d)

e)

f)

g)

No introduzca en las cubetaspipetas Pasteur u otros objetos que podrían
rayar las superficies ópticas. Vacíe las cubetas volcando el contenido al tubo
de ensayos o retire la solución usando una pipeta automática.
Enjuague por lo menos una vez las cubetas con la solución a medir, antes de
llenarlas definitivamente (el método se denomina “cebar”). Un procedimiento
alternativo es eliminar los restos de líquido de la cubetagolpeándola
suavemente sobre toalla Nova (varias capas de toalla).
Llene la cubeta hasta los 2/3 a 3/4 de su volumen total. No llene las cubetas
en exceso, pues el contenido puede volcarse. Recuerde que lo óptimo es no
tocar ni mojar las paredes ópticas de las cubetas, entonces no será necesario
limpiarlas. Antes de insertar la cubeta en el portacubetas del
espectrofotómetro verifique que...