Auditoria

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
ESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
CÁTEDRA DE INGENIERÍA GENÉTICA

NOMBRE: Gabriela Vásquez A. FECHA: 29/09/2012



TEMA: EXTRACCIÓN DE ADN DE PLANTAS Y CUANTIFICACIÓN DE ADN MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA UV

INTRODUCCIÓN:

Una de las primeras actividades que debe desarrollar el ingeniero genéticovegetal es la extracción de ADN de la planta objeto de su estudio, ya sea para determinar sus características, aislar un gen de interés, comprobar la presencia de una secuencia determinada, por ejemplo en estudios filogénicos, o para verificar la eficacia de un proceso de transformación.

El objetivo primordial consiste en obtener ADN de alto peso molecular y libre de proteínas, y otroscontaminantes (ADN de calidad). Esto se logra evitando la degradación o ruptura de ADN, por efecto mecánico o por acción de las nucleasas naturalmente presentes en el citoplasma celular, y regulando las condiciones del buffer de extracción de modo que el ADN sea liberado de la envoltura nuclear, los contaminantes sean retirados, las nucleasas inactivas degradadas y el ADN conservado en su estado activo.La determinación de la cantidad y concentración del ADN disponibles es primordial para las tareas que tiene ejecutar el ingeniero genético, tales como digestión con enzimas de restricción, ligación a vectores, modificación de los extremos de los insertos, fabricación de bibliotecas genómicas, amplificación mediante PCR, mutación in vitro, Southern Blot, marcaje con radiactividad ofluorescencia, etc., pues todas estas tareas requieren del uso de cantidades precisas de ADN.

La cuantificación del ADN mediante espectrofotometría se basa en la capacidad que tienen las bases nitrogenadas de absorber energía de cierta longitud de onda (260 nm), en una relación directa a su concentración en una solución. Se ha establecido una ecuación para establecer la concentración de ADN basado en lalectura de absorbancia. Una segunda lectura de absorbancia de hace a 280 nm para establecer la pureza de ADN, pues a esta longitud de onda absorben energía las proteínas, especialmente aquellas constituidas por aminoácidos aromáticos. La relación 260/280 indica la pureza del ADN, un valor de 1.8 en adelante es adecuado.

OBJETIVO:

* Obtener ADN de buena calidad a partir de hojas de Faique,desarrolladas in vitro
* Determinar la pureza, concentración y cantidad del ADN extraído mediante lecturas de absorbancia en un espectrofotómetro de UV.

REACTIVOS:

* Buffer de extracción CTAB 2X
* Cloroformo: alcohol isoamílico
* Etanol 70% frio
* Isopropanol
* Muestra de ADN en estudio
* Agua destilada estéril o Te

MATERIALES Y EQUIPOS:

* Cubetas decuarzo
* Piceta
* Micropipetas de 1-20, 100-100, y 100-1000 µl de volumen
* Puntas de micropipetas
* Espectrofotómetro UV

PROCEDIMIENTO:

* Colocar 3 ml de agua destilada en las dos cubetas de cuarzo.
* Añadir 5 µl de H2O o Te en una de las cubetas (blanco).
* Encerar el espectrofotómetro en 260 y 280 nm de longitud de onda.
* Añadir 5 µl de la muestra en elespectrofotómetro a 260 y 280 nm.
* Calcular la concentración de ADN y su calidad.
* Guardar las muestras de ADN a -20°C.

RESULTADOS:

Cuadro 1. Pureza de ADN obtenido en la muestras de Faique y Arrayán, realizadas en el Laboratorio de Biotecnología de la UCE – FCA. Septiembre de 2012

Muestra | A260 | A280 | Pureza ADN |
1 | 0.365 | 0.322 | 1.13 |
2 | 0.004 | 0.001 | 4.00 |
3 |0.005 | 0.003 | 1.66 |
4 | 0.007 | 0.007 | 1.00 |
5 | 0.030 | 0.030 | 1.00 |
6 | 0.008 | 0.008 | 1.00 |
7 | 0.343 | 0.310 | 1.10 |
8 | 0.012 | 0.008 | 1.50 |
9 | 0.02 | 0.012 | 1.66 |
Elaborado por: Gabriela Vázquez

Cuadro 2. Pureza de ADN obtenido en la muestras de Faique y Arrayán, realizadas en el Laboratorio de Biotecnología de la UCE – FCA. Septiembre de 2012

Muestra...