Bachiller

ESTIMACIÓN DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR EL MÉTODO DE FERMENTACIÓN DE TUBOS MULTIPLES

INTRODUCCIÓN

En este laboratorio, se realizará el método de fermentación de tubos múltiples, con el fin de estimar la población de coliformes en muestras de agua residual y embotellada. La densidad microbiana se estimará con ayuda de tablas NMP. Los coliformes, son un grupo bacteriano conformado porvarios géneros de la familia Enterobacteriacea, las cuales se caracterizan por ser bacterias aerobias y anaerobias facultativas, Gram negativas, no formadoras de esporas y con forma de bastón, que fermentan la lactosa produciendo gas y ácido en 48 horas a 35ºC.

Las técnicas de NMP, es un medio de estimar la densidad de microorganismos viables en una muestra. Se basa en la siembra de volúmenessecuénciales de base 10 (10, 1.0, 0.1, 0.01 etc.) para obtener un valor aproximado ya probado en poblaciones estimadas de microorganismos, especialmente en casos donde la densidad encontrada es predominante.

MATERIALES

-60 Tubos con medio BRILLA (Lactosa Bilis Verde Brillante):
-1 Jeringas de 10ml
-1 Jeringa de 1 ml
-150 ml de Agua de piscina, Bebidas callejeras.

PROCEDIMIENTO

Mayo6-2010
* Organizar los tubos de caldo Brilla en tres grupos de 5.
* Para agua embotellada (Baja carga microbiana), siembre directamente la muestra 10, 1 y 0.1 ml en cada grupo.
* En aguas con una alta carga microbiana realizar diluciones seriadas en base 10, para ello, tomar 10 gr/ml de muestra y 90 ml de agua peptonada (diluciones 1 en 10)
* Incubar a 35C +/- 2 ºC durante 24 a 48hrs.

INOCULO (ml) | Cantidad de medio en el tubo (ml) | Volumen del medio + inoculo (ml) |
10 | 10 | 20 |
1 | 10 o más | 11 o más |

LECTURA DE RESULTADOS

Mayo 7-2010
Considerar un tubo positivo, cuando se observé la turbidez y gas en los tubos invertidos. Proceder a la pruebaconfirmatoria. Realizar la lectura con ayuda de la tabla de NMP para cinco tubos.

Si utilizó un método directo, es decir, inoculó 10 ml, 1 ml y 0.1 ml, reportar el valor correspondiente a la combinación de resultados positivos y negativos como NMP/100 ml.

Si realizó diluciones decimales, seleccionar el valor de NMP dado en la tabla para la combinación de tubos positivos y calcular el valor con lasiguiente fórmula:

Valor NMP (tabla)*10/V=NMP/100ml

Donde:

V= volumen de una porción de la muestra en la dilución más baja (mayor concentración de bacterias) escogida.

Cómo se selecciona la dilución para realizar la lectura de los resultados?

Cuando más de tres diluciones son realizadas elegir la dilución más alta en la que sean positivos de formación de gas los 5 tubos y las dosdiluciones superiores más próximas. Si no hubiera ninguna dilución que presentara los 5 tubos (+), seleccionar las 3 diluciones más alta con algún tubo (+). Cuando la dilución más alta presenta también los 5 tubos (+), seleccionar las 3 últimas diluciones realizadas.

Para el cálculo del NMP para combinaciones que no aparecen en la Tabla 1, puede ser realizada por la formula de Thomas:NMP/100ml=(P*100)/√(N*T)

Donde:

P =Número de resultados positivos
N =Volumen de muestra en todos las porciones negativas combinadas
T = Volumen total de muestra en las diluciones seleccionadas.

PRUEBA CONFIRMATIVA

Incubar los tubos de fermentación con caldo Lauril Sulfato MUG ó caldo BRILA inoculado 24 +/-2 horas a 35ºC+/- 2ºC.
(1)
Producción de gas o acidez
Transferir a medio solidoAgar EMB
(2)
Ausencia de gas o acidez
Incubar otras 24 horas más (Total ,48 horas +/-3 horas)
(a)
Lectura de colonias típicas Presencia. Confirmación de grupo coliforme
(b)
Lectura de colonias típicas
Ausencia.
Resultado negativo.
Ausencia de Grupo coliforme
(a)
Producción de gas

Confirmar como en (1)

(b)
Crecimiento ácido.

Confirmar como en (1)
(c)
Ausencia de gas o...