Bacteriologa

1. Describa y fundamente algunos de los métodos comunes de extracción de ADN (salting out, fenol –cloroformo, cromatograficos, ebullición o Boiling, etc).
MÉTODO SALTING OUT:

Es un Método de purificación salina, en el que se reduce la solubilidad de algunas moléculas en una solución de muy alta concentración iónica. En este método se destruyen las membranas nucleares, liberando a lasolución los ácidos nucleicos. Seguidamente se precipitan los ácidos nucleicos debido a que el DNA presente en soluciones con alta concentración de sales puede precipitarse mediante la adición de solventes orgánicos como el alcohol etílico.

METODO FENOL – CLOROFORMO:

Este método de extracción de ADN por CTAB (Sal de amonio cuaternario) Permite obtener un ADN libre de proteínas y enzimas.Dentro de las funciones de sus reactivos encontramos que, el Fenol Diluye las Proteínas por ser de hidrófobas, luego el fenol es diluido por el Cloroformo. Como los ácidos nucleicos por su contenido en fosfato son hidrófilos, van a diluirse en fase acuosa formándose estas dos fases Tras un proceso de centrifugación.
Finalmente obtenemos un precipitado q vendrían a ser los ácidos nucleicos, que seve evidenciado al momento de pasar a un tubo diferente en donde se mezcla con etanol absoluto, el cual permite llegar a este resultado.

Proceso:

* Rotura de células: el cual se realiza agregándole unos componentes (CTAB 2%, Tris 0.2 M pH 8, EDTA 0.02 M pH8, NaCl 1.4 M, B mercaptoetanol 0.2%) proceso realizado con las basiloesporas se centrifuga y se toma en sobrenadante.

*Precipitación de proteínas: se añade fenol-cloroformo-alcohol isoamilico. Se toma la parte superior del micro tubo y se repite el proceso.

* Eliminación de fenol: se añade cloroformo y se toma la fase superior y se repite proceso.

* Precipitación de ácidos nucleicos: se agrega isopropanol i se incuba 1hora menos de 20°C.

* Lavado del precipitado: se elimina el sobrenadante y se lavacon etanol 70%.

METODOS CROMATOGRAFICOS:

Intercambio iónico: Este en uno de los métodos más utilizados en el laboratorio de biología molecular para la separación de ácidos nucleicos. Se utiliza por ejemplo para la separación de ácidos nucleicos de muestras tales como Semen y en paracitos. El fundamento de este método es el intercambio iónico en solución con sus grupos funcionales unidoscovalentemente a una resina Quelante es decir se da origen a una fase estacionaria insoluble. Por ejemplo: un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero efluirá de la columna al cambiar al pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o delintercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

Adsorción: este método se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de salescaotrópicos, este tipo de sales lo que hacen es desestabilizar la estructura de las diferentes moléculas de agua, es decir la capa hidratante que recurre a las biomoleculas y como por ejemplo el caso de la capa hidratante de las proteínas. Por otro lado los ácidos nucleicos también están recubiertos de una capa hidratante de moléculas de agua las cuales mantienen la solubilidad del DNA en solucionesacuosas. Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye las moléculas de agua, por lo que las sales cao trópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen, por lo tanto...