Bacteriologia 2

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
CURSO DE BACTERIOLOGIA GENERAL

Laboratorio 2. Parte B: Coloración de estructuras

Coloración de Gram para observación de pared bacteriana

Introducción
La coloración de Gram fue descrita en 1884, por el histólogo Christian Gram y aún hoy en día, sigue siendo la tinción mas empleada en microbiología. Estáclasificada como una coloración compuesta y diferencial, debido a que en el proceso se utilizan dos colorantes: el cristal violeta y la fucsina básica, y dependiendo del colorante que toma la pared, las bacterias se diferencian y agrupan en dos grandes categorías denominadas: Gram positivas las que se tiñen con el cristal violeta y Gram negativas las que toman el color de la fucsina básica. La reaccióntintorial que presentan las bacterias al ser coloreadas con Gram. demuestra que la composición química y estructural de la pared es diferente y. por consiguiente, permite que los colorantes se unan a sus compuestos moleculares en forma específica. De esta manera la tinción de Gram permite el reconocimiento primario de los microorganismos, la elección del tratamiento selectivo con antibióticos yel comportamiento de las bacterias frente a agentes físicos y químicos.

Tabla. Reacción de las bacterias frente a los componentes de la coloración de Gram

COMPONENTES
GRAM-POSITIVAS
GRAM-NEGATIVAS
Cristal violeta
La bacteria toma color violeta
La bacteria toma color violeta
Lugol
La bacteria toma color violeta
La bacteria toma color violeta
Alcohol acetona
Bacteria de color violeta.Deshidratación de paredes celulares, retracción de poros, disminución de permeabilidad
La bacteria se vuelve incolora, extracción de lípidos de la pared, mayor porosidad, liberación del complejo colorante-fijador
Fucsina básica
La bacteria permanece de color violeta
La bacteria se tiñe de color rosado




El control de calidad de la coloración de Gram se debe realizar por medio de un frotis con una mezcla dela bacterias Escherichia coli (bacilo Gram negativo) y Staphylococcus aureus (coco Grampositivo), siempre que sean de sistemas de referencia, para garantizar los resultados. Al observar el frotis coloreado con Gram se deben ver simultáneamente la morfología y coloración de los dos microrganismos. Si se observan únicamente bacterias violeta o Gram positivas, deberá aumentarse el tiempo dedecoloración con el alcohol acetona. Si por el contrario solo se ven bacterias rosadas o Gram negativas, deberá disminuirse el tiempo de la decoloración, hasta obtener la observación simultanea de los dos tipos de microorganismos, cada uno con su coloración correspondiente.

Objetivos
Adquirir destreza en la realización de la coloración de Gram.
Diferenciar bacterias Gram positivas de Gram negativas.Interpretar los resultados de la coloración de Gram.
Aprender a informar la coloración de Gram

Materiales
Curso:
Agar nutritivo (AN) sembrado con Klebsiella sp
AN sembrado con Staphylococcus sp
AN sembrado con Escherichia coli
AN sembrado con Bacillus sp
Colorantes de Gram
Microscopio
Aceite de inmersión

Estudiantes:
Cinta de enmascarar o marcador para vidrio
Láminas
Asas bacteriológicasProcedimiento
Marque una lámina limpia y desengrasada en uno de los extremos. Use cinta de enmascarar ó un marcador para vidrio.
Realice otro frotis a partir de los microorganismos que se encuentran sembrados en AN (un frotis diferente por cada microorganismo).
Fije el frotis con calor. Aplique sobre el frotis cristal violeta (colorante primario)
Deje actuar durante 1 minuto. Lave con agua y escurra
Apliquelugol y deje actuar durante 1 minuto. Lave con agua y escurra.
Aplique alcohol acetona, deje actuar durante 20 segundos. Lave con agua.
Aplique fucsina básica y deje actuar durante 1 minuto (colorante de contraste). Lave con agua y escurra.
Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el frotis coloreado
Enfoque con objetivo de 100X

NOTA: Antes de comenzar a utilizar el lote de colorantes...