Batrachochytrium dendrobatidis

Aislando y cultivando Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) en diez simples pasos Modificado de: Longcore JE, Pessier AP, Nichols DK (1999) Batrachochytrium dendrobatidis gen. et sp. nov., a chytrid pathogenic to amphibians. Mycologia 91: 219-227. Longcore JE, Culture techniques for amphibian chytrids: Recognizing, isolating and culturing Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Proceedingsof Getting the Jump! On Amphibian Diseases Conference / Workshop. Cairns, Australia, 26-30 August 2000: 52-54. Nota: El siguiente protocolo es el resultado de experimentos de “prueba y error” para establecer un método de trabajo con Bd. Estos son materiales y métodos recomendados, que se pueden modificar dependiendo de la situación o los recursos. Por ejemplo, es más fácil utilizar un microscopiode disección para examinar muestras de piel de rana que pueda tener Bd, pero si este equipo no está disponible (si se está haciendo este trabajo en el campo por ejemplo) el aislamiento de Bd es factible con paciencia, persistencia e ingenio. El mayor desafío a la hora de aislar y cultivar Bd es el evitar la contaminación de bacterias, levaduras u otros microorganismos. Lo más recomendado es quecada paso se realice en un ambiente estéril (idealmente en una cámara de flujo laminar), con materiales estériles. Sin embargo Bd ha sido aislado con éxito sin el uso de la cámara de flujo laminar. Debido a que los tiempos de crecimiento de Bd varían y la contaminación de las muestras es factible en todo momento, es recomendable que los cultivos sean revisados frecuentemente (cada 1-2 dias).Recuerde que Bd des un patógeno. Los desechos producidos durante el proceso de aislamiento y cultivo deberán de ser tratados con un químico desinfectante (como una solución al 10% de cloro) antes de que se ser desechados (Johnson & Speare 2003, Webb et al. 2006).

Materiales Platos de agar TGhL con antibióticos (vea receta abajo) Caldo de TGhL con antibióticos (ver receta abajo) Frasco estériles contapa de rosca Por ejemplo – frasco desechable para cultivo de tejidos de 25 cm2 Agujas estériles y/o fórceps Pipetas serológicas estériles de 5 o 10 ml Microscopio invertido Cámara de flujo laminar En caso de ser disponible: Microscopio de disección y compuesto Porta y cubre objetos Parafilm® o bolsas Ziplock®

Aislando Bd 1. Colecte los anfibios sospechosos de estar infectados con Bd • Anfibiosadultos: pueden estar muertos o moribundos con síntomas de infección de Bd (Berger et al. 1998, Pessier et al. 1999, Nichols et al. 2001). Renacuajos: Muchas especies pueden perder las estructuras bucales (pérdida de ¨dientes¨o pérdida de coloración de los mismos) (Rachowicz LJ 2002). Mantenga anfibios en un lugar fresco y húmedo, pero no saturado. El aislamiento debería de ocurrir de formarápida, ya que la descomposición hará el proceso más complejo y las probabilidades de éxito bajan. Por ejemplo: Lo más recomendado es aislar a Bd inmediatamente después de que el animal haya muerto. Si el tejido se mantiene en un lugar fresco y húmedo (~4ºC) es posible aislar el hongo hasta unos cuatro días post mortem.

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2. Remueva el tejido •

Remueva el tejido utilizando agujasestériles, forceps o un escalpelo. Adultos: piel suelta entre los dígitos posteriores o la piel ventral. Renacuajos: Partes bucales.

Si no hubiera piel suelta disponible, o la contaminación bacteriana es avanzada, se sugiere que tome un pedazos de piel utilizando un escalpelo o tijeras. - Nota sobre eutanasia: Una sobredosis de MS-222 mata a las ranas sin tener mayor efecto nocivo sobre Bd (Webb et al.2006). • Un microscopio de disección (20 o 40X) puede ser de gran ayuda para esta parte del trabajo.

3. Examine el tejido para ver si está infectado con Bd. • • Coloque un pedazo del tejido sospechoso sobre un porta objetos, agregue una gota de agua y cubra con un cubre objetos. Observe bajo un microscopio compuesto (100-400 X)

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Bd se identifica como unos cuerpos redondos, con...