BCA

CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS POR BCA


Utilizamos : Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific)

1-Preparación de reactivo BCA
En 1 tubo de 10 ml , mezclamos Reagent A yReagent B del kit, en la siguiente proporción :

50 l Reagent A / 1 l Reagent B

Utilizamos placa de 96 pocillos

2- Preparación de recta patron de BSA (Bovine Serum Albumin)
El patrón de BSA queviene con el kit tiene una concentración de 2mg/ml. Ajustar el volumen de BSA dependiendo de la concentración del stock.

g BSA
BSA l
BCA l
0
0
100
1
0.5
100
2
1
100
5
2.5
100
10
5
100
15
7.5
100
2010
100

Lo hacemos por triplicado para tener 3 lecturas

Esto se usa para generar una muestra patrón con g BSA en abscisas, y A562 en ordenadas. La recta es “buena” si 0.98
3- Preparación demuestras a cuantificar (normalmente por triplicado, pero depende de la cantidad de muestra que tengamos y la concentración que estimemos “a ojo”: si creemos que nuestra muestra está muy concentrada, sepueden hacer diluciones de uso para medir, ej. 1:2, o 1:5, usando buffer de lisis para no cambiar la composición, que puede afectar a las medidas).

x l muestra + 100 l BCA

4- Incubar 30minutos a 37º C , en estufa.

5- Lectura de valores de absorbancia en espectrofotómetro a =562 nm (algunos espectrofotómetros adquieren a 560 nm, esa medida también vale).

6- Idealmente, interpolamos losvalores obtenidos en la recta patrón (si no se pasan por mucho, se puede extrapolar usando la fórmula; si los valores se pasan por mucho, hay que repetir la recta usando diluciones de los lisados).7- La concentración final en g /ml viene dada por la media de valores para un volumen dado de muestra dividido entre los l de volumen.

Ej: en 3 l de muestra, obtenemos unos valores porinterpolación de:
2.5 g
3 g
3.5 g

el valor medio de estas medidas es 2.5 + 3 + 3.5 = 3 g
3 medidas

3 g = 1 g/l de proteína en nuestro lisado
3 l...

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