Beta galactósidasa










Laboratorio Nº2:
Actividad enzimática a distintas temperaturas










Estudiantes:
Michael McCullough

Lucas Lodeiro
Fecha entrega:
2 de Mayo 2013
I Resumen:
El objetivo de este práctico es analizar la actividad enzimática a distintas temperaturas, para poder comprender de forma empírica el funcionamiento de las enzimas.
Para esto vamos a trabajar conβ-galactósidasa, y el sustrato ONFG que es afín con la enzima, produciendo la reacción de hidrolización dos productos; Galactosa y el ONF. Este último tiene un color característico amarillo, ocuparemos esto para medir la concentración de dicho producto gracias al espectrofotómetro, y así comprender la actividad de la enzima.
Lograremos comprobar la mayor eficiencia de la enzima cuando la temperaturaes mayor, y la curva característica descrita por la enzimas.
























II Introducción:
Una enzima es una sustancia producida por un organismo vivo que actúa como un catalizador para llevar a cabo una reacción bioquímica específica disminuyendo la energía de activación de estas reacciones metabólicas, aumentando la velocidad en gran medida, siendoexclusivamente gracias a enzimas que algunas reacciones biológicas son viables.
Como la actividad catalítica de cada enzima es específica a un sustrato con características puntuales o un tipo de reacción, generando productos característicos, y teniendo un umbral máximo de efectividad y velocidad en condiciones específicas de pH y temperatura.
Este experimento se ocupamos la enzima β-galactósidasa, que esfundamental en el metabolismo de lactosa ya que hidrolizan galactosidos (disacáridos), y es esencial en el cuerpo humano y en otros organismos vivos como insectos, hongos, y varios tipos de protozoos.
La estructura de la β-galactósidasa es de un homotetrámero con una simetría 2,2,2 y su peso molecular suele ser grande fluctuando entre 100kDA (monómero) y los 464kDa (homotetrámero), pero su formaactiva más importante es el dímero con un peso molecular aproximado de 250kDa. Cada β-galactósidasa está compuesta por cuatro proteínas idénticas de 1023 aminoácidos, y cada cadena contiene 5 dominios, siendo el 3° el que contiene en sitio activo. Los sitios activos de la enzima están constituidos por un grupo sulfuhidrilo e imidazol, pero la presencia de iones monovalentes de potasio (K+) y deiones bivalentes de magnesio (Mg+) son necesarios para la óptima actividad enzimática. El sustrato tiene un enlace glicosídico que es clivado por un grupo carboxilo terminal de un ácido glutámico presente en la enzima. En este clivaje se da por adición de moléculas de agua. La β-galactosidasa escinde la molécula de lactosa en el enlace oxígeno-carbono glicosídico a través de una reacción dedoble desplazamiento en sus dos restos de monosacárido, la glucosa y galactosa.
El uso de orto nitrofenol β-galactósido (ONFG), cuyo masa molar es 301.249 y su fórmula molecular es C12H15NO8, es porque la β-galactósidasa tiene una gran afinidad por este sustrato, y uno de sus productos (ONF) funciona como un ¨detector¨ para ver si hay actividad enzimática de la enzima . El ONFG normalmente notiene color pero en la presencia de β-galactósidasa que hidroliza la molécula de ONFG en galactosa y orto nitrofenol, siendo este último compuesto el que otorga el cambio de color a amarillo y por lo que la intensidad del color producido se puede utilizar como una medida de la producción de ONF, analizando muestras en un espectofotometro a una absorción relacionada a una longitud de onde de 420nm,absorbancia en la cual la intensidad es directamente proporcional a la concentración del ONF y por ende la velocidad y eficiencia de la enzima podrá ser calculada. En este experimento también se ve la relación entre tiempo, temperatura, y concentración de ONFG en soluciones de 1,0 mM y 0,5mM con lo que se podrán observar y analizar otros factores relaciones a la actividad de la enzima.
EL...