Betaglucosidasa
Páginas: 12 (2800 palabras)
Publicado: 11 de mayo de 2012
LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES: CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LA β-GLUCOSIDASA DE ALMENDRA DULCE (Prunus dulcis)
Susana Estrada Cabello.
Procedente del grado de Bioquímica en la Facultad de Química, Universidad Complutense de Madrid.
INTRODUCCIÓN
Las glucosidasas [1] (también conocidas como glucósido hidrolasas) catalizan la hidrólisis de enlaces glucosídicos para generar glúcidosmenores. Las β-Glucosidasas son un grupo heterogéneo y bien caracterizado dentro de las enzimas glucosidasas. Son enzimas extremadamente comunes con papeles importantes en la naturaleza como el de la degradación de biomasa, tal como la celulosa o la hemicelulosa, en la defensa contra las bacterias, en mecanismos de patogénesis y en el normal funcionamiento celular. En mamíferos, las β-glucosidasascitosólicas procedentes del hígado o del riñón están implicadas en mecanismos de metabolismo de xenobióticos de la dieta. Junto a las glucotransferasas, las glucosidadas forman la mayor maquinaria catalítica para la síntesis y rotura de enlaces glucosídicos. También tienen gran interés industrial como catalizadores versátiles.
Los sustratos naturales de estas enzimas son múltiples, dependiendo delorganismo en el que se encuentren. Así, atendiendo a la especificidad de sustrato que muestren, las
β-Glucosidasas pueden agruparse en tres grupos fundamentalmente:
a) Aril-β-glucosidasas;
b) Celobiasas
c) β-glucosidasas de especificidad amplia
En nuestro caso, la enzima a estudiar es la β-Glucosidasa de la almendra dulce (Prunus dulcis).
La β-Glucosidasa de almendra es, conprobabilidad, la más utilizada en estudios cinéticos de las glucosidasas debido a que es fácil aislarla, la fuente es muy accesible, es comercial y sus ensayos utilizando como sustratos aril glucósidos son bastante fáciles de realizar. Sin embargo existen varias isoformas de esta enzima lo que dificulta en parte la interpretación de los resultados cinéticos.
El objetivo de esta práctica consistiráen la determinación de los parámetros cinéticos macroscópicos de la β-glucosidasa de almendra para el sustrato
p-nitrofenil- β-D-glucósido, la estandarización de las condiciones de ensayo de la
β-glucosidasa y el estudio de la inhibición de la catálisis de la β-glucosidasa.
MÉTODOS Y MATERIAL BIOLÓGICO
Material biológico.
Todo el experimento se realizada con una preparación comercial dela enzima
β-glucosidasa, de la casa FLUKA, aislada a partir de emulsina de almendras dulces (Prunus dulcis). La enzima es un homodímero (Mr = 67,000 por subunidad).[2]
Se procederá a la preparación de dos disoluciones; de grado analítico procedentes de la casa PANREAC.
* Disolución de tampón citrato sódico 100mM, pH 5 (pKa3= 5.4)
* NaOH 0.2N
El tampón será la base para lapreparación de los demás reactivos que proceden también de la casa FLUKA.
* Enzima β-glucosidasa, solución 170 nM (50 µg sólido/ml)
* Sustrato pNPG 50 mM
* Producto pNP 25 nM
Para los inhibidores se usan la :
* Glucosa 2.0 M
* δ-gluconolactona 20 mM
Métodos
● Valoración de la actividad enzimática.
Con este método se cuantifica la aparición de producto. El productoserá el pNP
(p-nitrofenol) utilizando como sustrato el pNPG (p-nitrofenil-β-D-glucósido). Según el procedimiento; en un tubo de ensayo se introducen 0.9 ml de tampón citrato sódico conteniendo el sustrato y se atemperan durante 5 minutos a 40ºC. Para que la reacción comience se añade 0.1 ml de la enzima, β-glucosidasa se introduce la mezcla, previamente agitada, en un baño de incubación a 40ºC.Transcurrido el tiempo de ensayo seleccionado se añaden 1.5 ml de NaOH, que actúa deteniendo la reacción, y se introduce en un baño de hielo. Para determinar la cantidad de producto (pNPG) liberado se procede a la medida de la absorbancia del ensayo a una longitud de onda de 410 nm.
La actividad de la enzima se determina mediante la concentración de sustrato consumido, o, lo que es lo mismo,...
Susana Estrada Cabello.
Procedente del grado de Bioquímica en la Facultad de Química, Universidad Complutense de Madrid.
INTRODUCCIÓN
Las glucosidasas [1] (también conocidas como glucósido hidrolasas) catalizan la hidrólisis de enlaces glucosídicos para generar glúcidosmenores. Las β-Glucosidasas son un grupo heterogéneo y bien caracterizado dentro de las enzimas glucosidasas. Son enzimas extremadamente comunes con papeles importantes en la naturaleza como el de la degradación de biomasa, tal como la celulosa o la hemicelulosa, en la defensa contra las bacterias, en mecanismos de patogénesis y en el normal funcionamiento celular. En mamíferos, las β-glucosidasascitosólicas procedentes del hígado o del riñón están implicadas en mecanismos de metabolismo de xenobióticos de la dieta. Junto a las glucotransferasas, las glucosidadas forman la mayor maquinaria catalítica para la síntesis y rotura de enlaces glucosídicos. También tienen gran interés industrial como catalizadores versátiles.
Los sustratos naturales de estas enzimas son múltiples, dependiendo delorganismo en el que se encuentren. Así, atendiendo a la especificidad de sustrato que muestren, las
β-Glucosidasas pueden agruparse en tres grupos fundamentalmente:
a) Aril-β-glucosidasas;
b) Celobiasas
c) β-glucosidasas de especificidad amplia
En nuestro caso, la enzima a estudiar es la β-Glucosidasa de la almendra dulce (Prunus dulcis).
La β-Glucosidasa de almendra es, conprobabilidad, la más utilizada en estudios cinéticos de las glucosidasas debido a que es fácil aislarla, la fuente es muy accesible, es comercial y sus ensayos utilizando como sustratos aril glucósidos son bastante fáciles de realizar. Sin embargo existen varias isoformas de esta enzima lo que dificulta en parte la interpretación de los resultados cinéticos.
El objetivo de esta práctica consistiráen la determinación de los parámetros cinéticos macroscópicos de la β-glucosidasa de almendra para el sustrato
p-nitrofenil- β-D-glucósido, la estandarización de las condiciones de ensayo de la
β-glucosidasa y el estudio de la inhibición de la catálisis de la β-glucosidasa.
MÉTODOS Y MATERIAL BIOLÓGICO
Material biológico.
Todo el experimento se realizada con una preparación comercial dela enzima
β-glucosidasa, de la casa FLUKA, aislada a partir de emulsina de almendras dulces (Prunus dulcis). La enzima es un homodímero (Mr = 67,000 por subunidad).[2]
Se procederá a la preparación de dos disoluciones; de grado analítico procedentes de la casa PANREAC.
* Disolución de tampón citrato sódico 100mM, pH 5 (pKa3= 5.4)
* NaOH 0.2N
El tampón será la base para lapreparación de los demás reactivos que proceden también de la casa FLUKA.
* Enzima β-glucosidasa, solución 170 nM (50 µg sólido/ml)
* Sustrato pNPG 50 mM
* Producto pNP 25 nM
Para los inhibidores se usan la :
* Glucosa 2.0 M
* δ-gluconolactona 20 mM
Métodos
● Valoración de la actividad enzimática.
Con este método se cuantifica la aparición de producto. El productoserá el pNP
(p-nitrofenol) utilizando como sustrato el pNPG (p-nitrofenil-β-D-glucósido). Según el procedimiento; en un tubo de ensayo se introducen 0.9 ml de tampón citrato sódico conteniendo el sustrato y se atemperan durante 5 minutos a 40ºC. Para que la reacción comience se añade 0.1 ml de la enzima, β-glucosidasa se introduce la mezcla, previamente agitada, en un baño de incubación a 40ºC.Transcurrido el tiempo de ensayo seleccionado se añaden 1.5 ml de NaOH, que actúa deteniendo la reacción, y se introduce en un baño de hielo. Para determinar la cantidad de producto (pNPG) liberado se procede a la medida de la absorbancia del ensayo a una longitud de onda de 410 nm.
La actividad de la enzima se determina mediante la concentración de sustrato consumido, o, lo que es lo mismo,...
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