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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.
La cromatografía de intercambio iónico se basa en las interacciones electrostáticas y permite la separación de macromoléculas en función de sus cargas mediante su interacción diferencial con una fase estacionaria de naturaleza iónica.
Res + A- + B- Û Res + B- + A
La fase estacionaria consta de intercambiadores iónicos (Res+), que son grupos cargadosunidos covalentemente a un soporte o matriz. Están asociados a iones de carga opuesta o contraiones (A-); la asociación reversible de éstos se intercambia y está en equilibrio con la de moléculas de los solutos de su misma carga presentes en la muestra (B-), entre los que está nuestra molécula de interés. La carga y naturaleza química de los intercambiadores determina la carga de los solutos iónicosque se unen a ellos y la fuerza con que lo hacen. Por su parte, la interacción de los solutos con los intercambiadores es más fuerte a medida que su relación carga/masa es mayor.
Esta técnica cromatografía es una de las más empleadas en Bioquímica, por la versatilidad que proporcionan la gran variedad de grupos intercambiadores disponibles, y sus respuestas a condiciones cambiantes de pH yconcentración iónica. Está muy indicada en las primeras etapas de los procesos de purificación, por su buena resolución y alta retención de solutos, aunque por la misma razón se puede usar en cualquier momento.
Según la carga de la fase estacionaria, hay- cr. de intercambio aniónico, en la que el intercambiador es un catión o base, es decir, una matriz con un grupo cargado positivamente, al que se unenaniones y polianiones. Los contraiones también son aniones (Cl-, acetato, OH-).
- cr. De intercambio catiónico, si el intercambiador es un anión o ácido, o sea, una matriz con un grupo cargado negativamente, al que se unen cationes y policationes. Los contraiones también son cationes (Na+, K+, H+).
Según la influencia del pH en la carga de los intercambiadores, éstos pueden ser fuertes o débiles,lo que en la práctica delimita el intervalo de pH en el que pueden ser manejados.- Fuertes: sus grupos están totalmente ionizados en un amplio rango de pH (más básico en catiónicos y más ácido en aniónico), de forma que su actividad o capacidad de intercambio se mantiene al máximo en todo ese rango. Entre ellos están TEAE (trietilaminoetil, aniónico), QAE (aminoetil cuaternario, aniónico) y SP(sulfopropilo, catiónico). Débiles: sus grupos están ionizados en un rango de pH más estrecho. La disociación, que define su carga y por tanto su capacidad de intercambio, varía mucho con el pH; en determinados rangos, la capacidad disminuye enormemente ante un aumento (aniónico) o disminución (catiónicos) de una unidad de pH.
Entre ellos están DEAE (dietilaminoetil, aniónico) y CM (carboximetilo,catiónico). Los rangos de pH aproximados de uso son, para intercambiadores fuertes entre pH 2 y 12, para los catiónicos débiles entre pH 5,5 y 12 y para los aniónico débiles entre pH 2 y 8,5.
Efectos del pH.
En principio, los intercambiadores débiles son mejores, porque permiten modular mejor su acción con el pH: pequeños cambios en el pH tienen más repercusión en la carga del intercambiador,sea para el proceso de carga o para el de elución. En todo caso, en intercambio iónico es especialmente necesario asegurar el pH de los medios de elución, dada la dependencia entre pH y estado iónico.
Por otra parte, también hay que tener en cuenta la relación entre la carga del soluto a separar y el pH del tampón. Las proteínas y otros polímeros poliónicos con cargas positivas y negativas puedenunirse tanto a intercambiadores catiónicos como aniónico, según su carga neta. Las proteínas poseen grupos cargados positivos y negativos en las cadenas laterales de los aminoácidos básicos y ácidos, y en los extremos amino y carboxilo. Las afinidades de unión de los polielectrolitos con grupos ácido-base dependen en gran medida del pH debido a la variación de su carga neta con él.
- si el pH =...