Biolixiviación

Medio líquido 9K (500mL)
(NH4)2SO4 6g/L
MgSO4 · 7H2O 0.5g/L
K2HPO4 0.5g/L
FeSO4 · 7H2O 7.5g/L
H2O destil·lada1L
pH final: 2
Introducir la muestra (calcopirita o pirita) en el medio liquido y dejar actuar diariamente ointerdiario removiendo hasta que aparezcan un color anaranjado en el medio, lo queevidencia la presencia de la bacteria, luego preparar el medio solido.


Per aïllarThiobacillus ferrooxidans ens basarem en la seva capacitat d’oxidar FeS2 ja que un dels productes d’aquesta reacció és el SO42-. Per tant, el pH del medi disminuirà. Preparem dos medis separats amb les següents característiques:
Medi A:
Sulfato de Amonio (NH4)2SO4
Cloruro de Potasio KCl
Fosfato de Potasio K2PO4
Sulfuro de Potasio heptahidratado K2SO4 ·H2O
Nitrato de Calcio CaNO3
MEdi B:Sulfato ferroso FeSO4
pH Final (25ºC) - 3.1 - 3.5

Suspender 3.85 g de Parte A del medio en 700 mL de agua destilada, que contenga 1 mL de Ácido Sulfúrico 10 N. 
Disolver el medio completamente, y añadir calor si es necesario. Aparte suspender 44.2 g de Parte B del medio en 300 mL de agua destilada. Esterilizar las Partes A y B del medio en el autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Dejar enfriar atemperatura ambiente y mezclar las dos partes en condiciones asépticas.
El agua de los jales de mina suele tener muchas partículas suspendidas, por lo que es recomendable realizar filtraciones y separar las partículas más grandes, así como el agua residual que contenga.
El procedimiento sugerido es la doble filtración de la muestra y posterior recuperación utilizando una solución ácida.
Sedeberá tomar 1 mL del agua muestreada utilizando una jeringa y haciéndola pasar por un filtro membrana de 10 µm de diámetro en el poro, y de este modo eliminar residuos de piedra y otras partículas macroscópicas que pueda haber en el agua.
Una vez filtrada la solución, debe hacerse pasar de nuevo por un filtro membrana pero ahora de 0.2 µm de diámetro en el poro. De esta manera, las bacterias nopodrán pasar y quedarán suspendidas en la membrana, a la cual se le realizarán varios lavados con una solución de Ácido Sulfúrico 0.1 N, hasta completar 1 mL de dicha solución.
Esta suspensión debe agregarse a 90 mL del medio Hierro-Oxidasa preparado previamente y dejado enfriar a temperatura ambiente.
El medio inoculado debe ponerse a incubar a 30ºC por 5 días, en una cámara de agitación orbitalya que el microorganismo es aerobio estricto y debe mantenerse una disponibilidad de oxígeno todo el tiempo.
Pasado el tiempo debe notarse un color café anaranjado y puede encontrarse unprecipitado en el fondo del matraz.

Terminado el proceso inicial de incubación que consiste en 5 días en agitación orbital, a 30ºC en medio Hierro-Oxidasa, se puede realizar una tinción de Gram para confirmarla presencia de microorganismos oxidadores del hierro.
La tinción de Gram consiste en utilizar dos distintos colorantes, uno rojo y uno azul, para distinguir una de las propiedades características de las bacterias: la alta concentración de peptidoglicano en la pared celular.
Aplicando esta tinción a una bacteria, se pueden tener dos resultados, Gram positivoo Gram negativo; donde una célularesultante Gram positiva indica la presencia de una pared celular más gruesa debido al peptidoglicano contenido, mientras que una bacteria Gram negativa tiene sólo un poco.
Teñir las células con cristal violeta (azul) y añadir lugol al iniciar la tinción, es lo que le da a la tincion de Gram la posibilidad de diferenciar, ya que estas dos sustancias cuando reaccionan se forma un compuesto insoluble enagua, por lo tanto, para decolorarse es necesario usar una solución de alcohol-acetona la cual aunque debilita la pared celular de las células más delgadas, las Gram Positivas debido a su pared más gruesa puede retener el colorante Azul dentro de ellas.
Una vez decoloradas las células, se tiñen con safranina (rojo), pero las células que ya están coloreadas azul no podrán tomar color de nuevo,...