Biología Celular




PRACTICA No. 1


OBTENCION, PURIFICACION Y CUANTIFICACION DE DNA CROMOSOMAL



OBJETIVO

Extraer, purificar y cuantificar DNA cromosomal de sangre periférica


INTRODUCCION

Es de gran importancia la extracción de ácido desoxirribonucléico (DNA) humano de alta pureza a partir de glóbulos blancos, para su aplicación en infinidad de estudios moleculares, como diagnóstico deenfermedades genéticas, determinación de polimorfismos, enfermedades infecciosas, pruebas de paternidad etc. Existen diversas técnicas que pueden ser utilizadas dependiendo del tipo de muestra que se estudie y el uso que se le pretenda dar. Lo importante es obtener la mayor cantidad de DNA y con un alto grado de pureza.


MATERIAL Y REACTIVOS


Espectrofotómetro UV/visible
Piceta con aguadestilada
Microcentrífuga
Agitador Vortex
Micropipetas de volumen variable (20, 200 y 1000 l).
Tubos Eppendorf
Puntas para micropipeta
Gradilla para tubos Eppendorf
Guantes de látex
Papel higiénico
Solución de extracción: Tris 10 mM pH 8.0, EDTA 20 mM pH 8.0, SDS 0.5%.
Buffer TKM1
Buffer TKM2
NaCl 0.4 M).
Triton X100
SDS al 10%
NaCl 5 M
Isopropanol
Etanol al 70%
Etanol absolutoH2O desionizada estéril




PROCEDIMIENTO

Extraiga 3 ml de sangre venosa periférica con anticoagulante.
Extracción de DNA mediante una técnica rápida, no enzimática, en muestras de sangre periférica.
1. Transferir 700 µl de sangre periférica a un tubo Eppendorf estéril de 1.5 ml
2. Adicionar 700 µl de buffer TKM1 y 18 µl de Tritón X100, agitar en el vortex hasta disolver totalmente.3. Centrifugar a 3,500 rpm por 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
4. Repetir los pasos 2 y 3 hasta observar el botón blanco (libre de hemoglobina).
5. Adicionar 700 µl de buffer TKM1.
6. Centrifugar a 3,500 rpm a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
7. Resuspender el botón en 120 µl de buffer TKM2 y adicionar 15 µl de SDS al 10%. Para muestras de salivaagregar 3.8 µl de proteinasa K y resuspender totalmente e incubar 30 minutos a 65° C o hasta la digestión.
8. Agregar 60 µl de NaCl 5 M y resuspender por agitación suave.
9. Centrifugar a 12,000 rpm a temperatura ambiente.
10. Recuperar el sobrenadante (que contiene el DNA) en un tubo Eppendorf estéril y desechar el precipitado proteico.
11. Agregar dos volúmenes de etanol absoluto frio einvertir varias veces suavemente el tubo hasta que el DNA se precipite.
12. Centrifugar a 5,000 rpm a 4°C por 10 min y decantar el exceso de etanol, después agregar 400 µl de etanol al 70% frio.
13. Centrifugar a 5,000 rpm a 4°C por 10 min y decantar el exceso de etanol y secar al vacio.
14. Resuspender el DNA con 100 µl de agua desionizada estéril

NOTA: antes de cuantificar se debe hidratar muybien la muestra, posteriormente realizar una o varias diluciones de la muestra (por ejemplo, 1:100, 1:200, 1:500) con agua desionizada estéril.


DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACION DE DNA POR ESPECTROFOTOMETRIA


PROCEDIMIENTO

1. Preparar una dilución 1:100 del DNA cromosomal en agua destilada en un volumen total de 500 l.
2. Leer la absorbancia en el espectrofotómetro UV/visible a 260nm o leer directamente la concentración. Si se lee la absorbancia, para calcular la concentración se considera que 1 D.O. corresponde a 50 g/ml de DNA de doble cadena.


CUESTIONARIO

¿Cuál es el fundamento teórico de la técnica de extracción del DNA?
¿Cuáles son los pasos críticos en la extracción?
Investigue otros métodos de extracción de DNA y coméntelos
¿Qué utilidad tiene estatécnica?


REFERENCIAS

Current protocols in molecular biology.
John Wiley & Sons, Inc. 1994.












































PRACTICA No. 2

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACION DE DNA POR ESPECTROFOTOMETRIA


OBJETIVO

Calcular la concentración de DNA de doble cadena por el método espectrofotométrico.

MATERIAL Y REACTIVOS...