Biologia molecuar

Universidad de Puerto Rico en Arecibo
Departamento de Biología

Artículo Molecular
Aquino Romero, Astrid C.; Beltrán Soto, Alejandro; Del Río López, Loida; González Figueroa, Jomara; Pérez Jiménez, Jailene I.; Rodríguez Luciano, Roselyn & Torres Marrero, Daleisha

Resumen
En este estudio se realizaron una serie de experimentos para observar cuán competente era E. coli BL21 en laexpresión de la proteína Glutatión-S-Transferasa (GST). En primer lugar, convertimos a E. coli BL21 en una célula competente para luego transformarla utilizando el vector pGEX-6P-2. Subsecuentemente, utilizando a E. coli BL21 ya transformada, se indujo la expresión de la proteína GST de Schistosoma japonicum en las mismas. Luego se purificó GST mediante cromatografía de afinidad utilizando la interacciónentre GST y glutatión. Paso siguiente, se analizó la concentración de proteína por espectrofotometría. Finalmente, se analizó la expresión y purificación de GST mediante electroforesis de poliacrilamida (SDS PAGE) y como último se analizó la expresión de GST en E. coli BL21 mediante la técnica de Western Blot.
Palabras claves: Glutatión-S-Transferasa (GST), pGEX-6P-2, espectrofotometría, SDSPAGE, Western Blot
Abstract
In this study we performed a series of experiments to observe how competent was E. coli BL21 in the expression of the protein Glutathione-S-transferase (GST). First, we converted E. coli BL21 in a competent cell and then transformed it using the vector pGEX-6P-2. Subsequently, using the transformed E. coli BL21, we induced the expression of the GST protein fromSchistosoma japonicum in them. GST is then purified by affinity chromatography using the interaction between GST and glutathione. Next, we analyzed the protein concentration by spectrophotometry. Finally, we analyzed the expression and purification of GST by polyacrylamide electrophoresis (SDS PAGE) and lastly, we analyzed GST expression in E. coli BL21 by Western Blot.
Keywords:Glutathione-S-transferase (GST), pGEX-6P-2, spectrophotometry, SDS PAGE, Western Blot
Introducción
La biología molecular tiene como objetivo el estudio de los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular. Es importante conocer que ésta biología es una de diversos usos hoy día como lo son la genética, la evolución, identificación de relaciones taxonómicas, búsqueda de genes deinterés entre muchos otros. En nuestro estudio se realizó una serie de pasos; los cuales fueron la preparación de células competentes de E. coli BL21 (DF3), la trasformación de estas células con un vector, la expresión de Glutation-S-Transferasa (GST) de Schistosoma japonicum en E. coli, la purificación de GST por cromatografía de afinidad, el análisis de concentración de proteína porespectrofotometría, el análisis de expresión y purificación de GST mediante electroforesis y por último se analizó la expresión de GST mediante “Inmunoblotting”. Para que ocurra la trasformación es necesaria la preparación de células competentes de E. coli, ya que naturalmente no lo es, y que ésta acepte ADN de su ambiente externo. Luego de esto es necesario trasformar las cepas artificialmente competentes deE. coli por el vector conocido como pGEX-6P-2. La expresión de GST, proteína utilizada como etiqueta para la purificación de proteínas de interés, mediante un sistema de expresión combina las células de E. coli BL21 (DE3) con el vector pGEX-6P-2, el cual contiene la secuencia codificante para GST; es necesario purificar este GST mediante el método de cromatografía de afinidad utilizando lainteracción entre la proteína y glutatión para poder remover aquellas proteínas que no tuvieron interacción específica con el ligando en la matriz utilizada. Luego se realiza un estudio de la absorbancia versus concentración para así poder determinar la concentración de las proteínas presentes. Estas muestras, ya purificadas en el trascurso de los distintos pasos, se analizaron mediante una...