Biologia Molecular: Proteinas Recombinantes Secuenciacion Organismos Trangenicos

BIOLOGIA MOLECULAR

TIPOS DE SECUENCIACIÓN
1) POR NANOPOROS
Consiste en la fragmentación del DNA, añadiendo adaptadores a ambos lados que se requieren en la purificación, amplificación, y secuenciación. Se obtiene cadenas simples.
Cada fragmento es capturado por una burbuja creada por la emulsión de aceite y agua. En cada una de las burbujas hay los reactivos de una reacción de PCRreplicándose cada fragmento muchas veces
Cada bola con sus fragmentos se introduce en el interior de un pocillo donde se añaden perlas con enzimas de reacción.
Las cadenas simples se completan en cadenas dobles con nucleótidos que emiten a una longitud de onda gracias a la sulfurilasa y luciferasa recogiendo asi la información de cada pocillo y procesándose en el software.
2) POR HIBRIDACIÓNBasado en la síntesis de bastantes sondas distribuidas ordenadamente como los arrays donde se probara el DNA marcado con fluoroforos y asi poder determinar la secuencia gracias al patrón y la intensidad obtenida.
3) POR LIGACIÓN

4) POR SINTESIS
Primero framgentamos el DNAy lo reparamos y adenilamos y luego se añade unos adaptadores en los extremos, amplificándolos y purificándolos.

Acontinuación, se tiene una placa con muchos adaptadores donde se unirán las cadenas simples trabajadas complementándose y obteniendo en cada pocillo muchas copias.

SECUENCIACION
Las cadenas cuando se complementan se hacen base a base y cada DNTP esta marcado con un fluoroforo disitnto dando así una información sobre la secuencia de DNA. Los nucleótidos compiten por ser los que se colocan por esohay una alta lectura bruta.

APLICACIONES
1) Lectuas largas (100 pb)
2) Precisión de lectura en bruto

TÉACNICAS AVANZADAS DE INGIENERIA GENÉTICA

ESTRATEGIAS ÓMICAS

1) GENÓMICA
Ciencia que estudia los genomas basándose en la secuenciación masiva
TIPOS
a) Genomica humana
b) Mitocondrial
c) Paleogenómica
d) Metagenómica ( material genética medio ambiental)e) Poblaciones de individuos

2) TRANSCRITÓMICA

Ciencia que estudia el mRNA siendo el transtriptoma: el contenido de mRNA de una célula reflejando el patrón de expresión génica en dicha célula.
La composición de este trastriptoma es muy complejo pues contiene cientos o miles de mRNAs.
La forma más directa para estudiarlo sería convertir el mRNA a cDNA y después secuenciar cada clon dela genoteca de cDNA.

ANALISIS ESTUDIADO POR
A) MICROARRAYS
B) SAGE
Gracias a esta técnica podemos obtener secuencias cortas de unas 12 pb de mRNA del trascriptoma
PROCESO
1) Se añaden bolas de celulosa con una cadena de timinas las cuales se unes a las cadenas poli A de los mRNAS.
2) Se sintetiza el cDNA
3) Con el enzima Allul se corta cada 4 pares de base
4) Seañade el linker que contiene el sitio de reconocimiento de BsmFI el cual cortara cada 10-14 pb generado los fragmentos de 12
5) Estos se recogen, se ligan juntos y forman moléculas grandes que se secuencian.

3) PROTEÓMICA
Ciencia que estudia a las proteínas analizando el proteoma ya sea por
a) Electroforesis de proteínas en 2D
b) Espectroscopia de masas

4) INTERCTÓMICASISTEMA DEL DOBLE HIBRIDO EN LEVADURAS
Las levaduras son capaces de sintetizar histamidina pero para ello necesitan los los dominios A y B en su promotor y estos dominios deben estar unidos. En el experimento lo que llevamos a cabo es la separación de estos dos dominios en dos plasmidos.
En uno estará el dominio AD junto con el gen Y ( que se une a X) el gen gal4( necesario para síntesis dehistidimina) y genes para la producción de leucina.
En el otro estará el dominio BD junto con el gen X el gal4 y el productor para triptófano.
Ambos plasmidos son inteoducidos en las levadurass que se hacen crecer en un emdio sin leu ni trp y se seleccionan solo aquellas que sobreviven. A continuación, se cultivan en un medio sin histimina y se seleccionan aquellas que han crecido. Estas...