biologia molecular


UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLINICO
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR


Taller 1. Métodos de extracción de ADN

DANIEL MONTAÑA RODRIGUEZ (IV A)
LAURA GONZALEZ RODRÍGUEZ (IV B)
CAMILA PEREZ LUGO (IV B)
Estudiantes:


GLADYS PINILLA B.
Docente:


Bogotá D.C
2011



1. SALTING OUT
Método propuesto porBunce M. Se basa en la lisis inicial de los glóbulos rojos mediante solución hipotónica y la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior eliminación de las proteínas mediante precipitación salina (salting out) y extracción con solventes orgánico. Se utiliza cuando la cantidad de DNA requerido para un estudio es menor a 1microgramo. Se distinguen 3 partes fundamentales del proceso: toma de muestra, extracción y purificación del DNA y precipitación y resuspención del DNA.
EXTRACCIÓN ORGÁNICA: FENOL-CLOROFORMO
La extracción orgánica de Fenol-cloroformo (abreviado PC o PERC) es una técnica de extracción líquido-líquido en bioquímica. Es ampliamente utilizado en la biología molecular para aislar el ADN, el ARN y lasproteínas. Volúmenes iguales de fenol: mezcla de cloroformo y una muestra acuosa se ​​mezclan, formando una mezcla bifásica. Este método puede tardar más que un sistema basado en columnas, pero tiene una mayor pureza y la ventaja de una alta recuperación de ARN. Fue realizado originalmente por Piotr Chomczynski y Nicoletta Sacchi y publicado en 1987 (conocida como Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformextraction). Se vende por Sigma-Aldrich por el nombre de reactivo TRI, por Invitrogen bajo el nombre de TRIzol y Bioline como Trisure.
CROMATOGRAFIA DE PENETRABILIDAD
El componente básico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partículas de un polímero orgánico de estructura tridimensional, que originan una red de poros hidrofílicos equilibrados con un tampón acuoso.La técnica consiste en que las moléculas de gran tamaño no penetran por los poros del polímero, por lo que migran mucho más rápidamente que las de menor tamaño que sí son capaces de penetrar por los poros de la matriz.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones ensolución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar al pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleicoo del intercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

CHELEX

La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras queconfinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos que pueden interferir en la PCR. De los tres pasos críticos que componen el análisis de patógenos por PCR (Fig. 1), la extracción de ADN es quizás el más desconocido y sobre el que más control podemos ejercer. La extracción del ADN de las células ovirus donde se halla confinado es un paso previo en muchos procedimientos analíticos y diagnósticos. Chelex®: resina de sílica que ayuda a separar selectivamente el ADN de la solución evitando la purificación de la muestra. Es un método rápido, pero muy poco eficaz en bacterias grampositivas.

BOILING
La extracción de plásmidos por calor (método de "boiling" o de Holmes y Quigley) se...