Biologia Molecular

Metodos Integrados en Biologia Molecular y Bioquimica
Clonaje y Transfeccion de un fragmento problema de cDNA.
Ana Roda Santacruz UAM• Abril 2012

Trenz Pruca • Correo electrónico: no_reply@apple.com • Escuela primaria

Metodos Integrados en Biologia Molecular
El objetivo principal de este modulo es el de clonar un fragmento de DNA de tipo circular, es decir, cDNA, en un plásmido, enconcreto GFP y su posterior expresión en células humanas. Para el cumplimiento de este objetivo, se realizaron diversas tecnicas de DNA recombinante, entre las que se encuentran: PRC, cultivo bacteriano, digestión con enzimas de restricción, ligación, etc.

AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA POR LA TÉCNICA DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR). La técnica conocida por las siglas PCR, esuna técnica usada para la amplificación de secuencias de DNA de forma especifica. La técnica consiste en la utilización de dos oligonucleotidos que hibridan en cadenas opuestas de un fragmento de DNA. La PCR se organiza siguiendo ciclos de desnaturalización del DNA, hibridación de los oligonucleotidos y extensión de los cebadores mediante una DNA polimerasa.

2

Por tanto, un ciclo de PCRconsta de 3 etapas: Para poder determinar si la PCR se realizo con exito, se realizo una electroforesis en gel de agarosa, cuyos resultados se muestran en la imagen a continuación:

Podemos observar que

Fig 1: Electroforesis en gel de agarosa. Comparado con marcadores de peso molecular φ 29/Hind III.

Como se puede observar en la figura, los resultados no fueron los esperados, dado que elcontrol positivo de la electroforesis no nos revela una banda luminiscente. Sin este control positivo, no podemos asegurar que la PCR se haya realizado de manera correcta, aunque si podemos observar una banda en el carril correspondiente al cDNA, revelándonos que si que hemos amplificado nuestro fragmento problema.

Distancia de migración vs. log del peso molecular

Distancia de migración (mm)

3025 20 15 10 5 0 y = -11.99x + 19.49

La distancia recorrida por nuestro cDNA problema es de 19 mm por 1.20 interpolándolo en lo que 1.40 1.60 -0.40 -0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
log del peso molecular 1,096 (1096 la ecuación de la recta convirtiéndolo a Kpb nos dadel fago Lambda pb).

Gráfica 1: Cálculo del tamaño del cDNA problema. Log del peso molecular en Kb de las bandas demarcadores de tamaño conocido y de la banda de cDNA problema.

3

Realizando la misma operación con el único control positivo del gel de agarosa se observa que la distancia de migración es la misma que el cDNA problema, 19 mm, y por lo tanto, aplicando la siguiente formula: y=-11,99x + 19.49, llegamos a la solución de que es un fragmento de 1096 pb. Determinación de la concentración de cDNA problemamediante el nanodrop con un resultado de 58.3 ng/µl con un ratio 260/280 de 1.82. La concentración del plásmido pEGFPC-1 fue de 228 ng/µl con un ratio 260/280 de 1,75. El rendimiento de la PCR fue el siguiente:

I.
II.

N = N0 (1 + y)n
N = número de copias de DNA resultantes de la PCR ; N0 = número de copias iniciales de DNA recombinante; y= eficiencia ; n = numero de ciclos

III. N = ? ;N0 = ? ; y = eficiencia teórica de la PCR = 0,8 ; n = 30 El objetivo, por tanto, de este apartado será el de la amplificación de un fragmento de DNA clonado en un plasmido, con el objetivo de crear nuevas dianas de restricción que nos permitan sublclonarlo en el plasmido de estudio. AISLAMIENTO DE DNA PLASMÍDICO POR EL MÉTODO DE LISIS ALCALINA El objetivo de esta técnica es el de la purificacióndel plasmido pEGFP-C1. Este método de purificación comienza con la sedimentación de las bacterias que habían sido crecidas en suspensión durante la noche anterior. También se procederá a la destrucción de su pared celular. De esta forma, las bacterias se lisan. A continuación se trataron con SDS e hidroxido sódico, provocando la desnaturalización del DNA bacteriano, pero no del plasmídico debido...