Biologia Molecular

1.- INTRODUCCIÓN
1.1 Tejido vegetal:
La resistencia del tejido vegetal depende de las paredes celulares, que son estructuras
similares a cajas que encierran, protegen y limitan la forma de todas las células. Dicha pared debe
ser resistente, pero no necesariamente rígida (Alberts et al, 2006).
1.2 Extracción de ADN:
La calidad del ADN es crucial para la aplicación exitosa de las técnicasmoleculares
(Ghislain.1998). Los métodos de aislamiento de ácidos nucléicos, sin importar el tipo o
procedencia, siguen siempre cuatro etapas básicas: 1. Lisis celular, 2.Inhibición de nucleasas, 3.
Desproteinización y 4. Precipitación de ácidos nucléicos (Giraldo et al., 2010).
El ADN puede aislarse mediante ruptura de tejidos, aprovechando las diferencias en las
propiedades de los ácidosnucleicos, proteínas y demás constituyentes celulares. Tras la lisis
celular, se trata de inhibir las nucleasas, ya que éstas degradarían el material a purificar, para
luego desproteinizar la muestra, ya sea mediante métodos químicos (solventes orgánicos,
detergentes no iónicos) o enzimáticos (proteasas) (Giraldo et al., 2010).
1.3 Cuantificación del ADN:
La concentración del ADN se puede estimarutilizando un espectrofotómetro de luz
ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm, debido a que las bases púricas y
pirimidínicas tienen la propiedad de absorber la luz UV a esa longitud de onda (Urueña y Puerta,
2005). La lectura a 280 nm nos proporciona la cantidad de proteínas en la muestra (Fonseca et al,
2010). La determinación de la pureza del ADN se establece mediante larelación de las lecturas
de las absorbancias a 260 y 280 nm (Urueña y Puerta, 2005). Una relación entre estas dos
medidas cercana a 2 indica mayor pureza del ADN (Fonseca et al, 2010).

2.- OBJETIVOS
2.1 Objetivos Generales
 Extraer DNA genómico a partir de una muestra vegetal.
 Cuantificar la concentración de DNA genómico con espectrofotómetro.

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3. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO
3.1Materiales:
Los materiales utilizados en el laboratorio fueron los siguientes:
-

Muestra vegetal (hoja de hortensia)
Solución de Chomczynski
Nitrógeno líquido
Cloroformo
Etanol absoluto ( a -20°C)
Etanol al 95% (a -20°C)
Agua destilada estéril
Tubos Ependorf de 1,5 ml
Mortero y pistilo
Micropipeta
Centrífuga

3.2 Procedimiento:
1. Se Pulverizó el tejido vegetal con nitrógeno líquido enun mortero y con ayuda de
pistilo.
2. Se homogenizó el tejido en 1,5 ml de Chomczynski y se centrifugó a 10000 g por 10
minutos a temperatura ambiente.
3. Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo ependorf.
4. Se adicionó 200 l de cloroformo, se agitó y se centrifugó a 10000 g x 10’ a
temperatura ambiente.
5. El sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo y se agregó 500 l de EtOHabsoluto.
6. Se procedió a mezclar por inversión y se dejó reposar por 3 minutos a temperatura
ambiente para luego centrifugar a 4000g durante 2’ a temperatura ambiente.
7. Se lavó dos veces en 200 l de etanol al 95% y se dejó secar a temperatura ambiente.
8. Posteriormente se volvió a lavar veces en 200 l de etanol al 95% y por cada lavado
se centrifugó a 6000 g por 2’.
9. Se secó el pellety se resuspendió en 500 l de agua destilada estéril.

2

4. RESULTADOS
4.1 Determinación de la concentración de DNA genómico para la muestra de Hydrangea
macrophylla.
Para conocer la real concentración se tuvo en consideración el factor de dilución obtenido
experimentalmente mediante las diluciones preparadas en el laboratorio (ver tabla 1).
La concentración de ácidodesoxirribonucleico (DNA) genómico de la muestra de nuestra planta,
específicamente de la hoja, se obtuvo mediante el uso del espectrofotómetro (ver tabla 2) y la
ecuación correspondiente (ver ecuación 1).
Tabla 1. Diluciones parciales realizadas en laboratorio y factor de dilución total.
Dilución

µl muestra

µl agua
ésteril

Dilución 1

50

450

9

90

9

Dilución 2 (obtenida 10
de la...