Biologia Molecular

CARRERA | PLAN DEESTUDIO | CLAVE ASIGNATURA | NOMBRE DE LA ASIGNATURA |
Disciplinaria | | | Biología Molecular |

PRÁCTICA No. | LABORATORIO DE | Biología Molecular | DURACIÓN(HORAS) |
5 | NOMBRE DE LA PRÁCTICA | ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA | 2 |

Elaboró:M.C. LUIS JESUS VILLARREAL GOMEZQ.F.B. JOSE ROMAN CHAVEZ | Revisó: |
ProfesorM.C. LUIS JESUS VILLARREAL GOMEZ | Coordinadorde programa educativoDRA. ANA LETICIA IGLESIAS |

Competencia:
Relacionar las propiedades electro-químicas de las proteínas y los ácidos nucleicos para el diseño de un método de separación selectiva dependiente de la carga eléctrica y el tamaño de las moléculas, para permitir el descubrimiento y aplicación de las bases fundamentales del diagnóstico molecular.
Fundamento
Laelectroforesis es la migración de iones en un campo eléctrico. Es una de las técnicas analíticas más importantes dentro de la Bioquímica. Las moléculas biológicas (ADN, proteínas, vitaminas, etc.) poseen cargas eléctricas, y por tanto poseen esta propiedad de movilidad en un campo eléctrico. La electroforesis en gel es el método más conveniente para realizar separaciones de macromoléculas (ADN yProteínas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un entramado tridimensional que impide o reduce la difusión. Este gel ha de ser compatible con los tampones usados y debe permitir la entrada del líquido en los poros (reticulados hidratables).
Electroforesis de ácidos nucleicos
La electroforesis de ácidos nucleicos es el método habitual para separar, identificar y purificar moléculas ofragmentos de ADN y ARN. En los tampones habitualmente utilizados, los ácidos nucleicos están cargados negativamente y migran hacia el ánodo. Cada molécula aporta una carga negativa (procedente del grupo fosfato), por lo que la relación carga/tamaño es prácticamente constante e idéntica para todas las moléculas, independientemente de su tamaño (un nucleótido tendrá la misma movilidad que un fragmentode doble cadena de 800pb o uno de 5kb).
La electroforesis de ADN se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida. Ambos soportes son restrictivos para los ácidos nucleicos, de modo que los diferentes fragmentos (al tener la misma relación carga/tamaño), migran en función de su tamaño y/o conformación (tabla II).
• Los geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean parafragmentos pequeños de ADN (5-500pb), así como para la mayoría de los ARN.
• Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos grandes de ADN (500pb-10Mb); utilizando agarosas de distintas concentraciones (distinto grado de reticulación) pueden separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo eléctrico constante; para separar fragmentos de tamaño superiores a 50kb seutiliza la electroforesis de campo pulsante en la que la dirección del campo eléctrico cambia periódicamente.
Electroforesis en geles de agarosa.
Se trata del método más común para el análisis, purificación y obtención de ADN. Las agarosas disponibles comercialmente presentan una amplia gama de grados de pureza y especificaciones. La presencia de polisacáridos sulfatados, contaminantes en algunasagarosas, puede ser perjudicial, ya que son inhibidores de las enzimas con las que va a tratarse el ADN purificado en la electroforesis (polimerasas, ligasas, endonucleasas de restricción, etc.).
Un aspecto importante de las agarosas es su estado físico. La agarosa estándar gelifica a 35°C y funde a 80-90°C, aunque las hay modificadas por adición de grupos hidroxietilo, que gelifican a menos de30°C y funden a 65°C. Estos datos son importantes, ya que finalizada la electroforesis, el gel se puede licuar a temperatura superior a la de fusión y así separar el ADN en disolución. Tabla I. Concentraciones de agarosa o acrilamida utilizadas para la separación electroforética de fragmentos lineales de ADN de diferentes tamaños. |
Agarosa (%) | Intervalo de tamaños separables (kb) |
0.3...