Biologia Molecular
Páginas: 5 (1133 palabras)
Publicado: 13 de noviembre de 2012
Preparación y análisis de DNA genómico
López Montes Nestor A.; Martínez Hernández Tomas E; Moreno Escalante Leticia J.
Introducción:
El ADN puede ser extraído de muchos tipos de materiales biológicos (sangre, tejido, hueso, diente, líquido amniótico, etc.) y el éxito del análisis molecular depende de su adecuado aislamiento en términos de cantidad, calidad y pureza; es necesario separar elADN del resto de los componentes celulares así como el material no biológico que pueda estar presente. Los protocolos de extracción buscan, en general, eliminar o diluir potentes inhibidores de reacciones de amplificación (grupos hemo, DNAsas, RNAsas, cristales, etc.) que eviten o dificulten análisis posteriores.
Metodología:
Se agregó 1.5 ml de cultivo de E. coli en un tubo Eppendorf y secentrifugó un minuto a 8000 rpm, se decantó el sobrenadante.
Se añadió 150 µl de TSND, se agitó por inversión hasta suspender la pastilla.
Se agregó 150 µl de fenol y se agitó por inversión.
Se agregaron 100 ml de Sevag y se agitó por alrededor de 10 segundos.
Se añadió 100 µl de buffer TE 1X y se mezcló por 10 segundos.
Se llevó a la centrífuga por 5 minutos a 14000 rpm.
Se transfirió lafase acuosa a un tubo nuevo.
Se adicionó 1 ml de etanol absoluto, se mezcló suave por inversión hasta hacer homogénea la solución, y se observaron fibras blancas (ADN).
Se llevó de nuevo a la centrífuga durante tres minutos a 14 000 rpm, posteriormente se decantó el sobrenadante teniendo cuidado de no desprender la pastilla de DNA formada.
Después se procedió a secarlo, colocando el tubo abiertocerca de un mechero encendido.
Y por ultimo se re suspendió la pastilla de DNA en 50 µl de TE 1X.
Preparación de DNA genómico
Análisis de DNA por electroforesis en gel y fluorescencia
Preparación de geles de agarosa
Se agregó en un matraz la cantidad necesaria de agarosa y TBE 0.5X para formar gel de 0.8%.
Después se colocó el gel en la cámara de electroforesis y se adicionó TBE 0.5Xpara cubrir el gel con profundidad menor a 1cm.
Después de 20-40min a temperatura ambiente, se retiró el peine y el resto del molde.
Posteriormente se vació la solución al molde cuando estuvo debajo de 60°C. Inmediatamente se colocó el peine evitando así la formación de burbujas.
Se calentó la mezcla en B. de agua, y se agitó hasta disolver la agarosa.
NOTA.- En la sesión del día 27 deagosto del 2012, no preparamos nosotros el gel la propia auxiliaría nos proporciono uno.
Aplicación de la muestra y estándares en el gel de agarosa y electroforesis.
Se mezcló en una superficie de parafilm 18 µl de muestra de DNA con 2 µl de jugo azul.
Aplicar corriente eléctrica 5 minutos a 70 volts y aumentar la corriente a 110 volts por 35 minutos.
Posteriormente se depositaron lamuestra en los pocillos utilizando una micropipeta.
Para la determinación de la concentración de DNA, se colocaron diferentes muestras y un control positivo.- fago lambda
Tinción:
Sumergir el gel 13 min en una solución de bromuro de etidio.
Observar las bandas del DNA en color entre naranja y rosa.
Colocar el gel en el transiluminador a 260nm.
Lavar el gel con agua destilada paraeliminar exceso de bromuro de etidio.
Comparar la intensidad de la fluorescencia de la muestra contra el control positivo (fago lambda).
Resultados:
Muestra
Fago lambda
En la muestra no se encontró DNA genómico. Al no realizarse la extracción adecuada y por motivo de contaminación de la muestra por la fase orgánica.
Discusión:
El procedimiento se elaboro de acuerdo a labibliografía correspondiente, entre las causas posibles de fuente de error fue al realizar la extracción, donde al retirar la fase acuosa se pudo arrastrar proteínas, sales y lípidos del tubo Eppendorf de 1’5 ml como se muestra en la Figura 1, ya que al realizar el centrifugado previo al lavado con etanol absoluto, se observó el precipitado de gran tamaño Figura 2, cuando debía de haber sido solo una...
López Montes Nestor A.; Martínez Hernández Tomas E; Moreno Escalante Leticia J.
Introducción:
El ADN puede ser extraído de muchos tipos de materiales biológicos (sangre, tejido, hueso, diente, líquido amniótico, etc.) y el éxito del análisis molecular depende de su adecuado aislamiento en términos de cantidad, calidad y pureza; es necesario separar elADN del resto de los componentes celulares así como el material no biológico que pueda estar presente. Los protocolos de extracción buscan, en general, eliminar o diluir potentes inhibidores de reacciones de amplificación (grupos hemo, DNAsas, RNAsas, cristales, etc.) que eviten o dificulten análisis posteriores.
Metodología:
Se agregó 1.5 ml de cultivo de E. coli en un tubo Eppendorf y secentrifugó un minuto a 8000 rpm, se decantó el sobrenadante.
Se añadió 150 µl de TSND, se agitó por inversión hasta suspender la pastilla.
Se agregó 150 µl de fenol y se agitó por inversión.
Se agregaron 100 ml de Sevag y se agitó por alrededor de 10 segundos.
Se añadió 100 µl de buffer TE 1X y se mezcló por 10 segundos.
Se llevó a la centrífuga por 5 minutos a 14000 rpm.
Se transfirió lafase acuosa a un tubo nuevo.
Se adicionó 1 ml de etanol absoluto, se mezcló suave por inversión hasta hacer homogénea la solución, y se observaron fibras blancas (ADN).
Se llevó de nuevo a la centrífuga durante tres minutos a 14 000 rpm, posteriormente se decantó el sobrenadante teniendo cuidado de no desprender la pastilla de DNA formada.
Después se procedió a secarlo, colocando el tubo abiertocerca de un mechero encendido.
Y por ultimo se re suspendió la pastilla de DNA en 50 µl de TE 1X.
Preparación de DNA genómico
Análisis de DNA por electroforesis en gel y fluorescencia
Preparación de geles de agarosa
Se agregó en un matraz la cantidad necesaria de agarosa y TBE 0.5X para formar gel de 0.8%.
Después se colocó el gel en la cámara de electroforesis y se adicionó TBE 0.5Xpara cubrir el gel con profundidad menor a 1cm.
Después de 20-40min a temperatura ambiente, se retiró el peine y el resto del molde.
Posteriormente se vació la solución al molde cuando estuvo debajo de 60°C. Inmediatamente se colocó el peine evitando así la formación de burbujas.
Se calentó la mezcla en B. de agua, y se agitó hasta disolver la agarosa.
NOTA.- En la sesión del día 27 deagosto del 2012, no preparamos nosotros el gel la propia auxiliaría nos proporciono uno.
Aplicación de la muestra y estándares en el gel de agarosa y electroforesis.
Se mezcló en una superficie de parafilm 18 µl de muestra de DNA con 2 µl de jugo azul.
Aplicar corriente eléctrica 5 minutos a 70 volts y aumentar la corriente a 110 volts por 35 minutos.
Posteriormente se depositaron lamuestra en los pocillos utilizando una micropipeta.
Para la determinación de la concentración de DNA, se colocaron diferentes muestras y un control positivo.- fago lambda
Tinción:
Sumergir el gel 13 min en una solución de bromuro de etidio.
Observar las bandas del DNA en color entre naranja y rosa.
Colocar el gel en el transiluminador a 260nm.
Lavar el gel con agua destilada paraeliminar exceso de bromuro de etidio.
Comparar la intensidad de la fluorescencia de la muestra contra el control positivo (fago lambda).
Resultados:
Muestra
Fago lambda
En la muestra no se encontró DNA genómico. Al no realizarse la extracción adecuada y por motivo de contaminación de la muestra por la fase orgánica.
Discusión:
El procedimiento se elaboro de acuerdo a labibliografía correspondiente, entre las causas posibles de fuente de error fue al realizar la extracción, donde al retirar la fase acuosa se pudo arrastrar proteínas, sales y lípidos del tubo Eppendorf de 1’5 ml como se muestra en la Figura 1, ya que al realizar el centrifugado previo al lavado con etanol absoluto, se observó el precipitado de gran tamaño Figura 2, cuando debía de haber sido solo una...
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