Biologia Molecular

Universidad de Sonora

Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas

Licenciatura en Biología

Biología Molecular

Reporte Laboratorio


18 de febrero de 2013

Introducción
El ADN fue aislado por primera vez en 1869 por el médico alemán Friedrich Miescher. La sustancia obtenida se encontró solamente en el núcleo, razón por la que fue originalmente llamada nucleína;posteriormente este término ha sido modificado hasta llegar a su denominación actual de ácido desoxirribonucleico.
El análisis de la molécula de ADN constituye una herramienta muy valiosa que ha permitido delinear estrategias aplicadas a la investigación básica y al diagnóstico de innumerables entidades de origen genético, basado esto en el principio de que la molécula de ADN es única en cadaindividuo y contiene toda la información necesaria para el desarrollo y función de los organismos.
El ADN puede ser extraído de muchos tipos de materiales biológicos y el éxito del análisis molecular depende de su adecuado aislamiento en términos de cantidad, calidad y pureza; es necesario separar el ADN del resto de los componentes celulares así como del material no biológico que pueda estarpresente. Los protocolos de extracción buscan, en general, eliminar o diluir potentes inhibidores de reacciones de amplificación que eviten o dificulten análisis posteriores. Idealmente los procesos de aislamiento deben ser rápidos y fáciles de realizar, garantizando la obtención del material genético aun con pequeñas cantidades de fluidos o tejidos.
El proceso general de aislamiento involucra trespasos: primero, la lisis de las membranas celulares, mediante el uso de buffer específicos y altas temperaturas; segundo, la degradación de las proteínas por incubación con proteinasa K; tercero, la extracción del ADN y su precipitación mediante el uso de alcoholes.
Objetivo
Que el alumno conozca los fundamentos básicos de la extracción de ADN en diferentes organismos y la importancia de cada pasodel protocolo. Para ello se utilizarán organismos como pollo, carne de res o marisco.
Materiales y reactivos
* Kit extracción de ADN “QIAmp DNA mini kit”
* Pistilos estériles
* Micropipetas de 1000 µl, 200 µl y 10 µl
* Puntas para micropipetas de 1000 µl, 200 µl y 10 µl estériles
* Microtubos de 1.5 ml estériles
* Espectrofotómetro Nanodrop
* Tejidos Carne de res opollo y marisco.
* Agarosa
* Cámara para electroforesis en Agarosa.
* Buffer TAE
* Transiluminador
Metodología
1. Pesar 25 mg de tejido y homogenizar con pistilo estéril y 80 µl PBS, posteriormente añadir 100 µl de buffer ATL y agitar al vortex.
2. Añadir 30 µl de proteinasa K, mezclar con vortex e incubar toda la noche a 56°C.
3. Añadir 200 µl de buffer AL, mezclarpor 15 segundos con vortex e incubar 10 minutos a 70°C.
4. Añadir 200 µl de etanol absoluto y mezclar con vortex.
5. Añadir toda la mezcla a la columna y centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) por 1 minuto a 4°C. Descartar lo que pasó por la columna al tubo colector.
6. Añadir 500 µl de buffer AW1, centrifugar a 6000 x g, 1 minuto a 4°C, descartar lo que pasó por la columna al tubo colector.7. Añadir 500 µl de buffer AW2, centrifugar a 6000 x g, 1 minuto a 4°C, descartar lo que pasó por la columna al tubo colector y volver a centrifugar.
8. Colocar la columna en un microtubo de 1.5 ml estéril y añadir a la columna 200 µl de buffer AE o agua estéril. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 6000 x g, 1 minuto a 4°C. Repetir este paso añadiendo 100 µl de bufferAE o agua estéril.
9. Realizar electroforesis en Gel de Agarosa al 1.2%
10. Realizar los cálculos para realizar un gel de agarosa al 1.2% en 50 ml de buffer TAE. A los 50 ml agregarles 2 ul de bromuro de etidio.
11. Correr el gel a 90 amps y tomarle una foto en el fotodocumentador equipado con un transiluminador de luz uv.

Resultados y conclusiones.
Esta práctica no tendrá un...