biologia

Marzo-Mayo 2010

Las tres generaciones de la
secuenciación

¿CÓMO FUNCIONA?

Rocío Bautista Moreno
Plataforma Andaluza de Bionformática, Universidad de Málaga
rociobm@scbi.uma.es
Cuando Sanger (1), con el método enzimático de terminación
de cadenas (método de los didesoxinucleótidos), y Gilbert, con el
método de fragmentación química, desarrollaron las primeras
aproximaciones a lasecuenciación del ADN en los años 70, ninguno de ellos pudo imaginar la velocidad a la cual evolucionaría este
proceso treinta años después.
Aunque el método de Maxam y Gilbert permitían secuenciar el
ADN original y detectar modificaciones en el mismo, el método de
Sanger es el que terminó siendo más popular. En sus orígenes se
trataba de un método muy manual, tedioso y peligroso (por el uso
decompuestos radioactivos), y con una capacidad de lectura de
unas 80 bases. El comienzo de los proyectos de secuenciación en a
finales de los 90 hizo que esta metodología se adaptara a estrategias menos nocivas gracias a la utilización de didesoxinucleótidos
marcados con fluorescencia que se analizaban en una electroforesis capilar y producían un cromatograma o electroferograma, a
partir delcual se deducía la secuencia en el ordenador. Esto permitió mejorar, automatizar y aumentar el rendimiento del proceso de
secuenciación. Estos nuevos avances posibilitaron el desarrollo de
los secuenciadores automáticos de tipo ABI Prism (Applied Biosystems) o CEQ-serie (Beckman Coulter). Esta tecnología permitía
secuenciar a la vez hasta 96 muestras de ADN en unas pocas horas,
y la longitud delas secuencias que producía estaba entre 500 y
1000 bases. Estábamos, llegando al límite de lo que se podía conseguir con la primera generación de secuenciadores automáticos.
La gran longitud de las lecturas generadas, en comparación con el
proceso manual, junto con el desarrollo de las estrategias de secuenciación a gran escala (Whole Genome Shotgun Sequencing)
facilitaban cada vez más elensamblaje de las secuencias genómicas.

Empujados por estos avances, en 1990 se firmó el «Proyecto
Genoma Humano». Más tarde, en 1995, se publicó el primer genoma secuenciado de un organismo de vida libre, Haemophilus
influenzae (3). En el 2001, años antes de lo que se tenía previsto,
se publicó el primer borrador el genoma humano, que costó casi
3.000 millones de dólares para leer 3.000 millonesde nucleótidos
(1 $/nt). Estos costes eran inasumibles para ningún laboratorio, lo
que estimuló a los científicos a buscar soluciones más baratas.
En esta búsqueda de abaratar costes se desarrollaron los
denominados secuenciadores de segunda generación, capaces de
generar cientos de miles de reacciones de secuencias en paralelo
(secuenciadores de verdadero alto rendimiento [high-throughput])gracias a la inmovilización de las reacciones en una superficie
sólida. De esta forma, la cantidad de reactivos necesarios se minimiza al máximo (podrían llamarse nanorreacciones) y se abarata el
coste por base leída. La primera aproximación a la secuenciación
masiva en paralelo está basada en la pirosecuenciación del ADN
(2). Se trata de una técnica no fluorescente que mide la liberación
depirofosfato en una reacción de polimerización mediante una
serie de reacciones enzimáticas acopladas que liberan luz cada vez
que se incorpora un nucleótido; producen una imagen que se
analizan para proporcionar flujogramas que, una vez interpretados
por el ordenador, devuelven las secuencias de nucleótidos. Esta
tecnología fue desarrollada por la empresa 454 Life Sciences que
fue absorbidapoco después por Roche
(http://genomics.org/index.php/454_GS_FLX). El primer modelo
comercial, el GS20, era capaz de secuenciar hasta 20 millones de
bases en unas 4 h. Mejorando simplemente la cinética de la reacción química de secuenciación, en el año 2007 apareció el modelo
GS-FLX capaz de producir hasta 100 millones de bases en un tiempo similar, en 2009 el GS-FLX-Titanium que genera...