biologia

Northern blot es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptido dado en una extracción de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, yaresuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcadaradiactiva o químicamente.1
El nombre de la técnica deriva de la propia de la detección de ácido desoxirribonucleico (ADN), denominada Southern blot en honor a su descubridor; de este modo, al desarrollarse la técnica equivalente para ARN se empleó el punto cardinal opuesto(«northern», septentrional en inglés, frente al meridional «southern»). El northern blot fue desarrollado en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford[cita requerida]
Procedimiento[editar · editar código]
El procedimiento general comienza con la extracción del RNA total de una muestra de tejido homogenizado. El mRNA se puede aislar a través del usode cromatografía para mantener solamente los ARN con colas de poli-A. Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas para penetrar en la matriz, las muestras de RNA, separadas por tamaño tras la electroforesis, serán tranferidas a una membrana de Nailon por medio de capilaridad o un sistema de transferencia al vacío.


Los sistemasde capilaridad iónica se utilizan pra transferir el ARN desde un gel de electroforesis a una membrana de Northern blot.
Una membrana de Nylon cargada positivamente es el soporte mas efectivo para usar en el northern blot ya que los ácidos nucleicos, que están cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas. El buffer de transferencia usado para el ensayo suelecontener formamida, dado que ésta consigue disminuir la temperatura de hibridación de la sonda, lo cual previene la degradación del ARN por las altas temperaturas. Una vez que el ARN ha sido transferido a la membrana, este es inmovilizado a través de enlaces covalentesformados con la membrana, lo cual se consigue por medio de luz ultravioleta o calor. Después del marcaje de la sonda, ésta se hibrida con el RNA enla membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y especificidad de la hibridación están determinadas por las condiciones iónicas, de viscosidad, la presencia de dobles hebras de RNA, bases desemparejadas y composición de las mismas. Finalmente, la membrana debe de lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma específica y para evitar ruido de fondo en lasseñales emitidas por la misma. Estas señales serán detectadas por Rayos X y pueden ser cuantificadas mediante técnicas de densitometría. Para crear controles y poder asegurarnos de que no se están mostrando genes que no nos interesen se puede realizar posteriormente la determinación por microarrays o RT-PCR.
Geles[editar · editar código]
iLas muestras de RNA son normalmente separadas en gelesde agarosa que contienenformaldehído como agente desnaturalizante del RNA para obtener su estructura secundaria. Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto suele limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un tamaño de poro mas estrecho en su matriz, porlo que el RNA que suele utilizarse no podría desplazarse por el gel. Suele utilizarse además un patrón de RNA con muestras de tamaño conocido para poder extrapolar el tamaño de las muestras en estudio.
Sondas[editar · editar código]
Las sondas del northern blot están compuestas por ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del RNA que nos interesa. Pueden ser de...