Biologia

TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Técnica de extracción y purificación de proteínas son más complicadas que la de los ácidos nucleicos Proceso: 1.- Lisis ( ruptura celular) 2.- Separación ó purificación de proteínas ► MÉTODOS DE RUPTURA CELULAR Y EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Objetivo: liberar proteínas evitando degradación térmica o alteraciones secundarias Métodos utilizados para lalisis celular ( ruptura membrana celular) - Homogeneización de los tejidos - Destrucción de las estructuras mediante procesos físicos ó químicos La elección del método dependerá de la localización y características mecánicas de los tejidos y células

Métodos químicos Objetivo: lisado ó homogeinado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y células rotas Utiliza tampones de extracciónsolubilizar proteínas disoluciones acuosas proteínas solubles disoluciones con detergentes purificar proteínas asociadas a membrana Para evitar cambios bruscos de ph, temperaturas extremas, acción de proteasas se trabaja con disoluciones tamponadas a bajas temperaturas para minimizar estos factores

► SEPARACIÓN/ PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS - MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS DE SEPARACIÓN Las separaciones sebasan en carga, tamaño y afinadad de las proteínas Métodos: - Cromatografía en columna ( más utilizada) - Cromatografía en papel - Cromatografía en plana

Métodos físicos mecánicos - Homogeneización por fricción de un émbolo moroeizado dentro de un tubo Un aparato Potter ( compuesto por un émbolo y un tubo) El émbolo pasa por un tubo rompiendo órganos ó tejidos blandos - Agitación con abrasivos Laruptura se realia en un mortero con arena ó alúmina ó e un molino con esferas de vidrio - Prensa francesa ó PAAF Hace pasar las células a gran velocidad a través de un orificio pequeño Métodos físicos no mecánicos Lisis osmótica Suspender las célular en una solución hipotónica El medio externo está más diluido que el interior celular La célula intentará equilibrarse por lo que dejará paso a éstasoluciónm Causará el hinchamiento de la célula y su posterior rotura debido a la gran cantidad de agua que entra en el medio celular Ultrasonicación Las células se someten a vibraciones de ultrasonidos que provocará su rotura Ciclo de congelación – descongelación Someter a la célula a cambios bruscos de temperatura 1º Congelar la célula a -195ºC 2º Calentar la célula a 25ºC Procesos repetidos queprovocarán la rotura celular

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE BAJA PRESIÓN Fase estacionaria: columna rellena de material sólido con características químicas adecuadas Fase móvil: solución tampón La fase móvil se hace pasar por la columna. El extracto crudo( ruptura celular) se aplica en la parte superior de la columna Cada proteína contenida en el extracto crudo se desplazará a velocidades diferentessegún sus propiedades Tipos : - Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular Fase estacionaria constituidas por partículas de polímeros de diferente porosidad Separación se basa en el tamaño de las partículas: Proteínas más grandes no pueden penetrar por los poros de la matriz y se eluyen cn más rapidez Proteínas de nemor tamaño penetran por los poros y se eluyen siguiendo un camino máslargo. Cromatografía de intercambio iónico

Columna está rellena de con un soporte cargado positivamente ó negativamente Las proteínas cargadas se unirán a este soporte dependiendo de su carga neta. Las más cargadas se unirán más fuertemente en el intercambiador que las menos cargadas por lo que serán más complicadas de eluir. Se eluirán primero las memos cargadas

Para eluir las proteínasfuertemente cargadas se subirá la fuerza iónca de la fase móvil GELES DE CONCENTRACIÓN FIJA Tipos de electroforesis: -Nativas - Desnaturalizantes

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Cromatografía hidrofóbica

Método similar a la cromatografía de intercambio iónico La proteína se pegará en el soporte gracias a sus aminoácidos polares. Cuanto mas residuos tenga en su superficie más tiempo estará retenida la proteína en la...