Biología Molecular

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA DE LOS RECURSOS NATURALES
INFORME DE LABORATORIO N.- 3

CURSO: Sexto “A” FECHA: 01/02/2015 CALIFICACIÓN:……………
ASIGNATURA: Biología Molecular
INTEGRANTES: Amaguaña Joselyn, Fonseca Ricardo, Herrera Mónica, López Ruth, Sánchez Cristofer, Villegas Abigail.
TEMA: EXTRACCIÓN DE ARNEN MATERIAL VEGETAL
OBJETIVO GENERAL: Extraer ARN de frutos de mora.
OBJETIVO ESPECÍFICO:
Extraer ácido ribonucleico (ARN) mediante un kit profesional.
Determinar los componentes que tiene un kit profesional para extracción de ARN.
Conocer la función de los diferentes reactivos utilizados en la extracción del ARN.
Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extracción deARN
Adquirir conocimiento básico para el manejo y cuidado de ARN extraído
MARCO TEÓRICO

En los organismos celulares el ARN es la molécula encargada de dirigir la síntesis de proteínas, pues aunque el ADN es el que contiene la información que determina la estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta información y producir las proteínas necesarias para eldesarrollo y actividades de la célula. La mayor dificultad en la extracción del ARN es evitar la contaminación con RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores para su función. Por lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-pirocarbonato (DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificación covalente (Chomczynski, 1987).

La mayoría de protocolos paraextracción de ARN están basados en el método descrito por Chomezynski y Sacchi, el cual se basa en el aislamiento de este ácido nucleico empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante el procedimiento debe realizarse una etapa de homogenización de la muestra con los reactivos que contengan la solución fenol-isotiocianato, donde este último se encarga de conservar la integridad delARN, mientras rompe las células y disuelve sus componentes, la adición posterior de cloroformo separa la solución en fase acuosa y orgánica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar por precipitación el ARN (Almonacid, 2008).
Esta técnica permite obtener ARN a partir de pequeñas cantidades de tejido y células en cultivo osuspensión de origen humano, vegetal, animal o bacteriano. Así mismo el ARN obtenido si se realiza el procedimiento con precaución está libre de contaminación con ADN, proteínas y finalmente puede ser utilizado en diferentes procedimientos como Northern blot, Dot blot, Transcripción reversa, ensayos de protección de RNAsas PCR y clonaje molecular. Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden serintroducidas accidentalmente durante el procedimiento de manipulación del ARN para obtener la segunda cadena o cadena complementaria (Revista Nature, 2009).
RECURSOS UTILIZADOS
Materiales
Reactivos
Equipos
Vaso de precipitación con cloro para desechos
Kit de extracción de ARN
Vórtex
Tubos eppendor de 1.5 ml auto clavados
Aspersor con etanol 70%
Microcentrifuga
Caja de puntas paramicropipetas pequeñas, medianas y grandes.
Agua destilada
Cámara de flujo
Micro pipetas 0,5-10, 10- 100 ul
Etanol absoluto
Congeladora
Marcador para vidrio
Mercaptoetanol

Carrusel para micro pipetas


Papel Aluminio



PROCEDIMIENTO
1. Realizar una maceración en morteros de la muestra con nitrógeno líquido, hasta obtener una masa homogénea.
2. Agregar 250mg de la muestramacerada en un tubo Eppendorf de 1.5ml.
3. En un tubo falcon preparar la solución del Buffer de Lysis que debe contener 1% de 2-mercaptoetanol por cada procedimiento de purificación, para el cual se adiciona 10μl de 2-mercaptoetanol por cada 1ml de Buffer de Lysis.
4. Se adiciona 1ml de Buffer de Lysis en el tubo Eppendorf que contiene la muestra macerada.
5. Llevar la preparación al vórtex...