Biomo Molecular

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

Esta técnica sirvepara amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguienteabaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las hebras de ADN para quevuelvan a duplicarlas.

Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus únicos requerimientos son que existan nucleótidos en el medio que son la materia base para fabricar el ADN (los nucleótidos de adenina, timina, citosina y guanina), y una pequeña cadena de ADN que pueda unirse a lamolécula que queremos copiar para que sirva como cebadora (el cebador, en inglés "primer").

Para realizar la técnica se necesitan:
Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+),agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+),
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de el ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Ciclo
Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) dela muestra la forma más habitual.

Alineamiento o unión del cebador
A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Lospuentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (uniónADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
Extensión o elongación de la cadena
Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadenacomplementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN.
La temperatura para este paso depende de el ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C).

PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)
Reaccion de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de...