Biomoleculas

Determinación de la Secuencia Amino-Terminal
Antes de secuenciar los péptidos es necesario eliminar los enlaces disulfuro dentro de los péptidos y entre los péptidos. Varias reacciones químicas sepueden utilizar para permitir la separación de los péptidos y prevenir conformaciones proteicas que son dependientes de puentes disulfuro. Los tratamientos más comunes son utilizar el2-mercaptoetanol o el ditiotreitol (DTT). Ambos productos químicos reducen los enlaces disulfuro. Para prevenir la reformación de los enlaces disulfuro los péptidos se tratan con ácido yodoacético para alcalinizarlos sulfhidrilos libres.
Hay tres importantes técnicas químicas para secuenciar los péptidos desde el N-terminal. Éstas son las técnicas de Sanger, Dansyl chloride y Edman.
Reactivo de Sanger: Estatécnica de secuenciamiento utiliza el compuesto, 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNF) que reacciona con el residuo del N-terminal bajo condiciones alcalinas. El aminoácido derivado se puede hidrolizar yserá etiquetado con un grupo dinitrobenzeno que imparte un color amarillo al aminoácido. La separación de los aminoácidos modificados (DNP-derivado) por electroforesis y la comparación con lamigración de los estándares del DNP-derivado permite la identificación del aminoácido N-terminal.
Dansyl Chloride: Como el DNF, el Dansyl chloride reacciona con el residuo N-terminal bajo condicionesalcalinas. El análisis de los aminoácidos modificados se realiza similar al método de Sanger salvo que los aminoácidos dansylated son detectados por fluorescencia. Esto imparte una sensibilidad más alta aesta técnica que al del método de Sanger.
Degradación de Edman: La utilidad de la técnica de degradación de Edman es que esta permite la secuencia de aminoácidos adicionales desde le N-terminal haciaadentro. Usando este método es posible obtener la secuencia entera de péptidos. Este método utiliza fenilisotiocianato para reaccionar con el residuo del N-terminal bajo condiciones alcalinas. El...