Bionanotecnologia


UNIVERSIDAD IBEROAMERICANA LEÓN
DEPARTAMENTO DE CIENCIA BÁSICA
BIOLOGÍA MOLECULAR


Extracción de ADN

OBJETIVO:

El alumno extraerá el ADN de una cepa de E. coli y de una muestra de suelo.


MARCO TEÓRICO:

Existen diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleídos con alto grado de pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultra centrifugación en gradientesde CsCl o una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas.

Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes: Desintegración del tejido y solubilización de los componentes celulares y precipitación de los ácidos nucleídos y disolución en un buffer adecuado.Homogenización de la muestra. El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para grandes volúmenes los tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de vidrio o de teflón). Larotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un motor), disgrega la muestra. Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelarla muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizada con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta de mantenga a muy bajas temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material de interés.

Como puede deducirse de los párrafos anteriores, se han descrito diverso métodos particularesa cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilizarían de los componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersalos componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas (dependientes del Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas.

Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros pasos siguientes de lapurificación de ácidos nucléicos, las moléculas de gran tamaño (tamaño, orden >millones de pares) es fragmentado mecánicamente.

MATERIALES:

Tubos

REACTIVOS:

Cultivo de E. coli incubado por 14-16 h a 37 °C con constante agitación de >200 rpm, 3 mL,
Una muestra de suelo


PROCEDIMIENTO:

Extracción de ADN de E. coli
1. Propagar un cultivo de E.coli en medio LB (3 mL) durante toda lanoche (14-16 h) a 37 °C con agitación constante de > 200 rpm
2. Colocar 1 mL de cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
3. Centrifugar el tubo a 7000 g durante 2 min.
4. Decantar el sobrenadante.
5. Agregar 250 L de agua desionizada estéril al paquete celular.
6. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células (aprox. 30 s).
7. Agregar 250 L defenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).
8. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
9. Agregar 250 L de cloroformo.
10. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
11. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
12. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 L) y colocarla en otro tubo de 1.5 mL. En ocasiones en la interface se presenta un precipitado blanco,...