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Manual de Laboratorio de Bioquímica I

PRACTICA NO. 8 AISLAMIENTO Y PROPIEDADES QUIMICAS DE LA HEMOGLOBINA Y SUS DERIVADOS

INTRODUCCIÓN La hemoglobina (Hb) es una molécula localizada en los eritrocitos. Su función principal es transportar oxígeno desde los pulmones a los tejidos del cuerpo. La hemoglobina está formada por cuatro cadenas polipeptídicas, 2 cadenas α y 2 cadenas β. Las cuatrocadenas polipeptídicas de la Hb contienen cada una un grupo prostético llamado hem. La forma desoxigenada de la Hb es conocida como deoxihemoglobina, mientras que la forma oxigenada se conoce como oxihemoglobina. En el momento en que la deoxihemoglobina se combina con el oxígeno hay un desplazamiento en el espectro de absorción y el color de la sangre se modifica de rojo oscuro a rojo brillante. Uncambio opuesto ocurre cuando la sangre se desoxigena. Lo anterior explica la diferencia de color entre la sangre venosa y la sangre arterial. Tanto en la deoxihemoglobina como en la oxihemoglobina el hierro presente en el grupo hem se halla en la forma ferrosa y no es oxidado cuando se oxigena. Existen formas alteradas de la hemoglobina, conocidas como derivados de la hemoglobina. Por ejemplo, siel hierro ferroso se oxida a hierro férrico por medio de un agente oxidante, entonces se forma metahemoglobina y la molécula no se puede combinar luego con oxígeno. Normalmente, la sangre humana contiene únicamente 1% de metahemoglobina, pero esta concentración puede aumentarse después de ingerir ciertas drogas. Los derivados de la Hb presentan diferentes espectros de absorción. En la siguientetabla se presentan las longitudes de onda con la absorción máxima para diferentes derivados de la hemoglobina: Derivado de hemoglobina Hemoglobina Oxihemoglobina Carboxihemoglobina Metahemoglobina Absorción máxima (nm) 555 430 -577 541 413 570 535 418 630 500 406

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Manual de Laboratorio de Bioquímica I OBJETIVOS • • • Efectuar el aislamiento de la hemoglobina a partir de sangre completahumana. Realizar experimentalmente la transformación de la hemoglobina a diferentes derivados de la misma. Efectuar el espectro de absorción de seleccionados derivados de la hemoglobina y analizar los resultados obtenidos con base a las propiedades químicas de cada compuesto.

MATERIAL BIOLOGICO • Sangre completa con anticoagulante (heparina)

REACTIVOS • • • • • • • • • NaCl 1.2% (p/v) ToluenoReactivo de Stokes. (Debe ser preparado inmediatamente antes de usarlo).
Disolver 20g. de FeSO4 *7H20 y 30 g de ácido tartárico en agua destilada y aforar a un litro.

Reactivo de Stokes amoniacal. (Prepararlo en el momento de usarlo).
Colocar en un tubo 2 mL del reactivo de Stokes y agregar NH4OH gota a gota hasta que cambie a color verde.

NH4OH concentrado Ferricianuro de potasio al 0.2%(p/v) Ferricianuro de potasio al 10% (p/v) Acido ascórbico 0.5 M en buffer de acetato (0.5 M pH 4.5) NaNO2 0.5 M en buffer de acetatos (0.5 M, pH 4.5).

EQUIPO • • Centrífuga Espectrofotómetro

MATERIALES Y CRISTALERIA • • • • • • • • Embudo de decantación Cubetas para espectrofotómetro Tubos de ensayo Beaker 50 ml Probeta de 50 ml Parafilm Pipetas volumétricas de 5 ml Goteros plásticos 2Manual de Laboratorio de Bioquímica I • Guantes

PROCEDIMIENTO 1. Preparación de la solución concentrada de oxihemoglobina • Centrifugar 50 ml de sangre con anticoagulante para sedimentar los eritrocitos. Decantar y lavar los eritrocitos con un volumen igual de NaCl al 1.2%, mezclando cuidadosamente por inversión. Centrifugar y descartar el sobrenadante. Repetir este paso hasta que el sobrenadantese vea claro y limpio Hemolizar las células del sedimento, agregando 1.2 volúmenes de agua y 0.4 volúmenes de tolueno. Mezclar vigorosamente en un embudo de decantación y dejar en reposo a temperatura ambiente durante una hora. Al finalizar este tiempo descartar la capa de tolueno, la cual contiene material lipídico. Centrifugar la capa acuosa a 1000 g durante 15 minutos y descartar el...