Bioquimica 1 y 2

PRACTICA DE LABORATORIO N° 1 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA
I.-INTRODUCCIÓN:
Las enzimas son biocatalizadores específicos de naturaleza proteica que actúan acelerando las reacciones químicas experimentando cambios físicos durante ellas, pero recuperando su estado original cuando dichas reacciones han culminado. De manera general, una reacción química catalizada por una enzima serepresenta de la siguiente manera:
SUSTRATO + ENZIMA COMPLEJO ENZIMA – SUSTRATO ENZIMA+PRODUCTO
II.-MATERIALES:
1.-Material biológico: Enzima Ureasa (E.C. 3 5 1 5 Urea hidrolasa)
2.-Material y Equipo de Laboratorio:
* Gradillas para tubos
* Tubos de ensayo de 13x 100 mm (07)
* Pipetas de 1ml (02; uma al 1/100), 2ml, 5ml y 10 ml.
* Baño de María a 37 ° C
*Goteros o pipetas descartables de plástico
* Pizeta con agua destilada
* Espectrofotómetro o Fotocolorímetro
3.-Reactivos:
* Buffer Tris HCl 0.05 M pH 7.2
* Solución de urea 0.075 M en buffer Tris HCl 0.05 M, pH 7.2
* Solución de ureasa 0.05%
* Solución de Hg Cl2 1%
* Solución de rojo de metilo de 0.04 %
III. PROCEDIMIENTO:
A.- Sistema de incubaciónCOMPONENTES (ML) Y PROCESO | TUBOS |
| 1 | 2 |
Buffer Tris HCl 0.05 M pH 7.2 | 0.5 | 0.5 |
Urea 0.075 M bufferada | 3.0 | 3.0 |
Mezclar y pre-incubar a 37°C por 5 minutos |
Ureasa 0.05 % | …… | 0.5 |
Mezclar suavemente e incubar a 37°C por 15 minutos |
HgCl 1 % mezclar | 2 gotas | 2 gotas |
Ureasa 0.05% | 0.5 | ……. |

ESQUEMA DE LA PRACTCA


IV.CUESTIONARIO:
1.- Explicar el diseño experimental:
* ¿Cuál es el propósito de cada tubo?
El propósito de cada tubo es el de comprobar las prueba realizada con diferentes condiciones dadas, en este caso, con ureasa agregada luego de haber detenido la síntesis (tubo 1), y cuando se agrego ureasa antes de haber detenido la síntesis (tubo 2).

* ¿Cuál es el tubo de control?
El tubo de controles el tubo 1, ya que este tubo nos permitió comparar y observar las reacciones sin que se haya agregado la sustancia reactante, en cambio el tubo 2 nos permitió observar como sucedió la reacción con el reactante agregado.
* ¿Es necesario más de un tubo de control?
Sería necesario más de un tubo de ensayo siempre y cuando la cantidad de muestra que queramos analizar sea grandey también cuando sean muchas pruebas las que tengamos que realizar.
2.- Observe las reacciones en los tubos de titulación y anotar sus observaciones en la sección resultado. Explicar sus conclusiones en la discusión.
Los tubos de ensayo tuvieron distintos resultados ya que los efectuamos desde distintas perspectivas, es decir mediante un método de neutralización y mediante un método de colorimetría. Enel primer método luego de agregar un colorante especial (rojo de metilo) lo titulamos con un ácido fuerte (HCl) hasta lograr un cambio de color permanente, en función a la cantidad de ácido necesitado para la titulación nos damos cuenta de la cantidad de producto que se produjo en la reacción; En la segunda prueba agregamos un reactivo especial que produce un cambio de color (reactivo de Nessler), paraluego poder medirlo en un fotocolorímetro y saber la cantidad de concentración del producto analizado.

3.- Calcule las unidades de ureasa a partir de sus resultados.
vol. HCl gastado TUBO 1 = 0.02 m l
vol. HCl gastado TUBO 2 = 1.3 m l
NEUTRALIZACION
VELOCIDAD = (volumen HCl gastado (problema) – vol. HCl (blanco)) (molaridad) (1000)(4)(15 minutos) (2)(2)
VELOCIDAD = (1.3 m l – 0.02 ml) (0.05 N) (1000)(4) = 4.27 mM/ min NH3 ( PH 7.2 -37 °C)
(15)(2) (2)
COLORIMETRIA:
Lecturas en el fotocolorímetro
Tubo blanco= 0
Tubo 1 = 0.02
Tubo 2 = 0.6
>Tubo blanco –tubo 1 = 0 -0.02 = -0.02…………… (x)
>Tubo blanco – tubo 2 = 0 – 0.6 = -0.6…………… (y)...