Bioquimica Enzimas

Enzimología
Introducción
Las enzimas son biocatalizadores específicos y potentes que posibilitan la coexistencia de un elevado número de reacciones químicas dentro de la célula, sin ellas las reacciones metabólicas se desarrollarían demasiado lentas para la vida. (1) Las enzimas suelen ser muy específicas tanto del tipo de reacción que catalizan como del sustrato involucrado en la reacción.El grado de especificidad es muy alto debido a la forma particular de una pequeña parte conocida como sitio activo. Este sitio activo es la zona de la enzima a la que se une el sustrato para ser catalizado.
La actividad de la mayoría de las enzimas depende de un pH característico al cual la velocidad es óptima. (2) Por tal motivo la actividad enzimática se mide en presencia de tampones oamortiguadores de pH.
Es bien conocido el hecho de que al aumentar la temperatura, aumenta la energía cinética de las moléculas reaccionantes. Como las reacciones enzimáticas no son una excepción a esta regla, su velocidad aumenta con la temperatura. Pero cuando la temperatura llega a cierto valor, variable según la enzima, esta empieza a desnaturalizarse y la velocidad de reacción comienza adisminuir. Se habla así de una temperatura óptima que es aquella en la que la velocidad de la reacción es mayor. (3)
En la siguiente experiencia se trabajara con la enzima fosfatasa acida de germen de trigo, la cual cataliza la hidrólisis de fosfato monoésteres, con liberación de fosfato inorgánico. Se utilizara un sustrato artificial, p-nitrofenil fosfato (NNP). El grado de hidrólisis de dichosustrato, se determinara espectrofotométricamente cuantificando el p-nitrofenol liberado, que en una solución alcalina, absorbe fuertemente 405 nm.
Objetivos
* Determinar los parámetros cinéticos de la enzima fosfatasa
* Conocer procedimientos para determinar actividad enzimática
* Verificar los efectos de inhibidores sobre los parámetros cinéticos de una enzima
* Aplicar conceptos desustrato, inhibidor competitivo, inhibidor a competitivo
* Ser capaces de analizar y expresar gráficamente los resultados.
Materiales y métodos

Resultados

Gráfico 1: “Curva de calibración del p-nitrofenol”
Se puede observar que midiendo del tubo 2 al 6 (tubo 1 es el blanco) la concentración de p-nitrofenol y la absorbancia aumentan proporcionalmente, arrojando una ecuación que se podráutilizar para determinar los parámetros cinéticos de la enzima.

Tabla 1: “Parámetros cinéticos de la fosfatasa acida de germen de trigo sin inhibidor”
En el parámetro sin inhibidor la absorbancia es relativamente alta. El tubo 1 no fue considerado ya que es el blanco.
  |   | pNP | pNP real |   |   |
Tubo | Abs | (Producto) | (Producto real) | V0 (sin I) | [S] |
2 | 0,564 | 124,5 |622,6 | 62,261 | 0,25 |
3 | 0,675 | 149,8 | 748,8 | 74,875 | 0,50 |
4 | 0,794 | 176,8 | 884,0 | 88,398 | 0,75 |
5 | 0,830 | 185,0 | 924,9 | 92,489 | 1,00 |

Tabla 2: “Parámetros cinéticos de la fosfatasa acida de germen de trigo con inhibidor”
En el parámetro con inhibidor, la absorbancia en comparación con el sin inhibidor disminuye considerablemente ya que disminuye la actividadenzimática.
  |   | pNP | pNP real |   |   |
Tubo | Abs | (Producto) | (Producto real) | V0 (con I) | [S] |
7 | 0,141 | 28,4 | 141,9 | 14,193 | 0,25 |
8 | 0,222 | 46,8 | 234,0 | 23,398 | 0,5 |
9 | 0,314 | 67,7 | 338,5 | 33,852 | 0,75 |
10 | 0,401 | 87,5 | 437,4 | 43,739 | 1 |

Tabla 3: “Recíprocos con y sin inhibidor.”
1/[s] | 1/V0 I- | 1/V0 I+ |
4,0 | 0,016 | 0,070 |
2,0 | 0,013 |0,043 |
1,3 | 0,011 | 0,030 |
1,0 | 0,011 | 0,023 |

Gráfico 2: “Gráfica de Lineweaver-Burke”
Lo que indica el gráfico principalmente son las ecuaciones de la recta de las enzimas con y sin inhibidor. De acuerdo a ellas se puede saber cuáles son las Km y Vmáx de cada una con la ecuación:
1/v = Km/Vmáx * (1/[S]) + 1/Vmáx
Con inhibidor Km =1,752 nm...